第九章 PCR技术及其在医学上的应用.ppt

第九章 PCR技术及其在医学上的应用 TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993 forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA basedchemistry MichaelSmith 1944 1932 2000 LaJolla CA USA KaryB Mullis UniversityofBritishColumbiaVancouver Canada forhisinventionofthepolymerasechainreaction PCR method forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide based site directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies 一 PCR基本原理 DNA模板变性 95 左右高温变性单链DNA模板与引物退火 引物与模板形成复合物的几率 DNA分子自身的复性引物的延伸一个PCR循环即 变性 退火 延伸 经过30个左右的循环后 PCR的扩增倍数为 1 x n x 75 n为循环数 第一节PCR原理与特点 靶序列 未扩增的DNA 变性 退火 延伸 变性 退火 延伸 PCR示意图 5 端是人工合成的引物 是特定的 3 端没有固定的终止点 特定的的扩增产物在第2个循环中出现 以后快速扩增 成为主要扩增产物 变性 退火 延伸 n个循环后 5 端是特定的人工合成的引物 3 端没有固定的终止点的DNA链扩增量为2n Taq聚合酶的性能模板DNA的拷贝数底物dNTP浓度其他多种因素 30个循环后出现 平台效应 平台效应出现的早晚取决于 二 PCR技术的特点 高度的敏感性 是最主要的特点 25个循环可扩增106倍 它可对单拷贝 单根头发 一滴血等微量标本进行分析高度的特异性 取决于2个引物设计的好坏 依赖于引物与模板结合的正确性 退火温度操作简便 快捷适用样品的广泛性 第二节PCR系统的组成及PCR最适条件 耐热DNA聚合酶寡核苷酸引物dNTPPCR反应缓冲液模板DNAPCR循环数易发生的问题及解决方法 一 耐热DNA聚合酶 必需金属离子Mg2 Mg2 Mg2 Mg2 3 5 外切活性 5 3 外切活性 逆转录活性 Mn2 Mn2 未定未定耐受100 该酶的出现使PCR操作大大简化 克服了以前每一循环反复加Klenow酶的缺点 各种耐热DNA聚合酶的特性 TaqTthVENTSac TaqDNA聚合酶的种类 天然酶 嗜热水生菌分离纯化基因工程酶 AmlpiTaqTM 5 3 DNA聚合酶在Mn2 存在下 逆转录酶活性最佳有5 3 外切酶活性无3 5 外切酶活性 无校正功能PCR产物末端加1个非模板依赖性碱基 优先为A 是TA克隆的基础 TaqDNA聚合酶的特性 TA克隆定义 利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性 在70 75 活性高 使PCR产物的3 末端加一个A的粘性端 将其直接克隆至3 粘性末端含一个T的线性克隆载体中 TA克隆方法 一步PCR克隆 PCR扩增 连接 转化 蓝白筛选 校正聚合酶 平端PCR产物 二 寡核苷酸引物 引物长度在15 30个碱基 人基因组有3 109bp 19mer引物 419 2 75 1011中重复1次 引物的碱基的分布是随机的 避免5个以上的嘌啶和嘧啶的连续排列 尤其3 不应有连续3个G或C避免两引物间的互补 特别是3 端引物自身不应有连续超过3个bp的互补序列引物的3 端不能有任何修饰 3 决定产物的特异性引物的5 端限定PCR产物的长度 5 端可进行修饰引物与非扩增序列同源性应 70 或 连续8个互补扩增编码区中 引物3 端不要终止于密码子的第3位 引物的设计直接关系到PCR的特异性与成败 引物的设计原则 现有引物设计程序或软件 PCR反应引物的常用浓度范围 PCR反应中引物的浓度是0 1 1 mol L在100 l中引物的量为25 100pmol 假如用25 mol L浓度的引物贮备液只需加1 4 l 三 dNTP dNTP是dATP dCTP dGTP dTTP的总称dNTP在50次循环中是稳定的dNTP在PCR中的常用浓度是20 200 mol L试剂公司已将其pH调至7 0 7 5要避免反复冻融 分装冻存于 20 每种贮存液浓度为5 10mmol L 一般为10mmol L 4种合并后浓度即为2 5mmol L100 l的PCR反应中 假如用各2 5mmol L浓度的dNTP混合液贮备液只需加0 8 8 l注意Mg2 浓度与dNTP浓度之间的关系 四 PCR反应缓冲液 Tris Cl pH8 3 8 8 KCl 50mmol L 或 NH4 2SO4 25mmol L 促使引物退火MgCl2 25mmol L 影响酶活与精确度 产物的特异性明胶 5 或BSA或Tween 20 稳定酶活性甲酰胺 5 使引物与模板特异性配对 五 模板DNA 来源 广泛要求 待扩增部分需部分纯化用量 ng的量克隆DNA g水平的染色体DNA抽提方法 简单的水煮沸法去垢剂裂解细胞 蛋白酶消化蛋白 有机溶剂抽提 乙醇沉淀核酸扩增产物长度 检测性的长度一般为500bp 100 300bp为好 克隆片段则不受此影响 六 PCR循环数 其他参数选定后 PCR循环数主要取决于模板DNA的浓度PCR循环数一般为25 30 七 易发生的问题及解决方法 假阴性假阳性PCR产物呈片状非特异性扩增 易发生的问题 假阴性 是否加入Taq聚合酶 酶活性如何 DNA解链是否充分 PCR仪在变性可否达到解链温度样品中有酶抑制剂 95 10min使用多组分引物 作双重PCR 解决方法 假阳性 设立阴性对照 空白对照避免操作污染避免阳性对照以检测样品的污染 解决方法 PCR产物呈片状 减少聚合酶浓度增加退火温度减少循环数 解决方法 非特异性扩增 增加退火温度 减少退火时间及延伸时间降低引物与聚合酶浓度改变Mg2 的浓度 解决方法 第三节PCR技术的发展 外源基因的分离基因重组DNA测序构建克隆或表达载体定点突变检测某基因的多态性转座子插入位点绘图检测基因修饰 PCR及其衍生技术的应用 TA克隆定义 利用嗜热DNA聚合酶如TaqDNA聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性 在70 75 活性高 使PCR产物的3 末端加一个A的粘性端 将其直接克隆至3 粘性末端含一个T的线性克隆载体中 TA克隆方法 一步PCR克隆 PCR扩增 连接 转化 蓝白筛选 校正聚合酶 平端PCR产物 PCR克隆技术PCR直接测序技术定量PCRPCR体外定点突变PCR与突变的分子水平分析修饰PCR不对称PCR反转录PCR通用引物PCR套式PCR PCR及其衍生技术的种类 单一特异性引物PCR随机引物PCR倒向PCR免疫PCR碱基替代PCR锚式PCRmRNA差别显示原位PCR膜结合PCR简并引物PCR 第四节PCR技术在医学上的应用 感染性疾病病原体的诊断和研究遗传病相关基因的检测恶性肿瘤的诊断和研究法医学研究在骨髓移植配型中的应用 一 感染性疾病病原体的诊断和研究 对形态和生化反应不典型的微生物病原体的鉴定解决混合标本问题生长缓慢或难于培养的病原体的鉴定难于鉴定的病原体诊断 HIVHCV与HEVHPV结核杆菌其他病原微生物 鉴定新病毒 二 遗传病相关基因的检测 巴氏水肿胎儿的产前诊断镰形细胞贫血杜氏营养不良症 DMD 甲型血友病胎儿性别鉴定 巴氏水肿胎儿综合征 地中海贫血中最严重的一种 4个 珠蛋白基因全部缺失 1条染色体应有2个珠蛋白基因 珠蛋白形成 4 即HbBarts 对氧亲和力极高 常致胎儿窒息死亡 广东 广西多发 巴氏水肿胎儿的产前诊断 设计1对引物PCR扩增 珠蛋白基因 同时增加1对引物扩增 珠蛋白基因作内对照正常胎儿可扩增出136bp片段巴氏水肿胎儿不能扩增136bp片段 镰形细胞贫血 原因 珠蛋白链第6位的GAG GTG 造成Glu Val所致 设计一对引物PCR扩增可得294bp OxaNI消化 电泳 bp 杜氏营养不良症 Duchennemusculardystrophy DMD 男性常见的致死性X性连锁隐性遗传病以往检测基因缺陷方法 Southern印迹杂交缺点 须用10余种探针 操作费时 同位素用量大 所需DNA量多 难于适应产前诊断的要求PCR方法 设计9对引物 用于扩增9个易缺失区 一次PCR同时扩增 某个片段无扩增则说明该段外显子缺失 针对可疑的男性胎儿进行DNA检测 优点 方法简单 快速 便于临床使用 甲型血友病 最常见的遗传病凝血功能障碍所致的出血性疾病 为X性连锁隐性遗传病 是F 基因缺陷所致临床无满意治疗措施 检出携带者及产前诊断 防止婴儿出生是降低发病率的主要措施 首先明确胎儿性别 女性不必作基因诊断 男性可作下列PCR检测 甲型血友病 PCR方法 设计1对引物 扩增F 第18外显子内142bp 内含BclI bp PCR产物的BclI酶切后电泳结果 胎儿性别鉴定 预防性连锁遗传病胎儿的出生 应用 切不可滥用 以免导致胎儿出生性别比例失调 性连锁遗传病的分析法医学的个人鉴定 如犯罪人员 性器官发育异常的基因检测 包括一些运动员的性别鉴定 指导性矫形手术 出生后的性别鉴定应用 1990年确定决定人类性别的基因位于Y染色体短臂的1A1上 即SRY基因 sex determiningregionoftheY 染色体上如缺SRY 即发展成女性 设计扩增人SRF基因和X Y同源序列的2对引物进行PCR bp 鉴定诊断率100 三 恶性肿瘤的诊断和研究 恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测癌基因 抗癌基因缺失与点突变的研究肿瘤相关病毒基因的研究 1 恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测 某些白血病与特定的染色体的易位或基因重排有关如95 CML都存在ph染色体 产生t 9 22 形成ber abl融合基因 转录成嵌合mRNAPCR检测 设计1对引物扩增ber abl嵌合mRNA 本法可检测1个ph阳性细胞 105正常细胞该法也可用于淋巴瘤t 14 18 q32 q21 1 恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测 PCR法可检测1 5个肿瘤残留细胞 104 105正常细胞PCR为肿瘤的诊断 预后判断 微量残留细胞提供了快捷 正确的方法 以往检测缺失方法 较大缺失在显微镜下分析 微小缺失用印迹杂交PCR法检测 简单引物设计方法 小缺失 设计1对引物分别与缺失两侧的序列互补 大缺失 在缺失区内设计1对PCR检测缺失 小缺失样品 扩增片段长度变短 大缺失样品 无靶DNAPCR扩增产物PCR检测突变方法 PCR SSCP 引物竞争PCR和PCR直接测序法 2 癌基因 抗癌基因缺失与点突变的研究 2 癌基因 抗癌基因缺失与点突变的研究 小缺失 大缺失 缺失区 缺失区 3 肿瘤相关病毒基因的研究 HBV 与原发性肝癌HPVEBV 鼻咽癌 Burkill s淋巴瘤 传染性单核细胞增多症 何杰金氏病HCMV 在宫颈癌 前列腺癌 肠癌和Koposi肉瘤中可检测到HTLV 1 人类嗜T细胞白血病病毒 慢性进行性脊髓病和T淋巴细胞白血病HTLV PCR可用于 淋巴细胞增生性疾病和神经系统的病人和携带者的检测