抗生素在花生组织培养中的抑菌效应研究.doc

抗生素在花生组织培养中的抑菌效应研究任艳1，2，李雷3，王辉1，石延茂1，李双铃1，袁美1* 收稿日期：2009-09-08基金项目：山东省农科院博士基金（2006YBS021）和青年基金（2005YQ010），科技部863项目(2006AA100106)作者简介：任艳(1979-), 山东苍山人，中国海洋大学硕士研究生，山东省花生研究所助理研究员，主要从事花生生物技术研究。 通讯作者（1. 山东省花生研究所，国家花生工程技术研究中心，山东 青岛 266100；2. 中国海洋大学，山东 青岛 266100；3.青岛市农业科学院，山东 青岛 266100）摘要：在花生组织培养中，分别加入不同抗生素，研究利用抗生素解决花生组织培养中常见的细菌性侵染问题。结果表明，培养基中添加抗生素能有效抑制花生组培苗的细菌性侵染。其中氨卞青霉素对继代苗抑菌效果最好，对生长发育影响也较小。培养基中添加抗生素对花药初接的培养抑菌效果不明显，对花药的生长影响也较大，效果不理想。关键词：花生；组织培养；抗生素；抑菌效应组织培养是花生新品种选育的重要手段，但由于组培室温度较高（28左右），组织培养过程中会遇到大量的细菌性侵染，并产生恶性循环，给试验带来巨大的损失。抗生素在低浓度下就能抑制它种微生物的生长和活动,甚至杀死它种微生物。自抗生素发现以来,以其高效低毒广泛应用于临床医学和作为动物饲料添加剂,但在植物上的应用甚少。随着人们对抗生素作用机理的了解,抗生素也开始应用于植物,并取得了显著效果。本实验尝试用抗生素抑制细菌的侵染，在处理污染的花生组培苗的过程中，能达到较好的抑菌效果。而在花生花药培养过程中，用抗生素却没有达到较好的抑菌效果。1材料与方法1. 1材料供试材料为继代细菌污染的花育28组培苗,由山东省花生研究所提供。花药 选用的抗生素为氨苄青霉素(Amersco分装) ;利福平(MDBio)、卡那霉素 (MDBio) 、盐酸四环素(Amersco)、羧卞青霉素(MDBio); 链霉素（）1. 2实验内容与方法1. 2. 1. 1 继代培养基的准备在花生组织培养苗继代培养基中，每种抗生素的加入浓度分别为30、60 、120mgL , 以不加抗生素为对照。事先将每种抗生素分别配成100 gL 的母液, 并经细菌过滤器过滤后备用;按常规方法配制花生组织培养苗继代培养基, 并按每瓶30 m l 分装在锥形瓶中, 封口后在温度121 、压力1. 1 kgcm 2 条件下灭菌25 m in, 培养基冷却凝固前在超净台上按实验设计浓度分别加入抗生素母液, 并振荡均匀, 做好标记。每种抗生素每个浓度处理各6 瓶,不加抗生素的空白对照10 瓶, 以供实验用。1. 2. 1. 2 组培苗培养抑菌实验 将受到细菌侵染的花育28继代组培苗, 分别转接至添加抗生素后保存10 d 以上、无任何杂菌侵染的每个浓度处理培养基中, 每处理接种6 瓶; 将受到细菌侵染的花育28继代组培苗接种至未添加抗生素、且无任何杂菌侵染的10 瓶培养基上为对照(CK)。每瓶培养基接种4 个继代组培苗, 置于光强控制在3 000 L x,16 h 光照, 8 h 黑暗, 白天温度28 , 夜间28 的组织培养室内进行培养, 25 d 后观察记载各处理试管苗受细菌侵染瓶数及生长情况。1. 2. 2. 1 花药培养基的准备 以不加抗生素的花药培养基C3为对照, 在C3培养基中添加浓度60mg/L 的链霉素标记为C3S，在C3培养基中添加浓度60mg/L 的羧苄青霉素标记为C3C。1. 2. 2. 2花蕾处理抗生素用量花蕾设6个处理T1T6, T1T6分别为添加链霉素5gL；链霉素1g/L；羧卞青霉素5gL；羧卞青霉素1gL；链霉素1g/L 和羧卞青霉素1gL；链霉素5g/L 和羧卞青霉素5gL 。 1. 2. 2. 3花药的灭菌处理： 75酒精浸0.51 min,在0.2升汞中消毒10 min，用无菌水洗涤34次，每次35分钟；1) T0: 无抗生素浸泡;2) T1-T6抗生素浸泡15min剥离花药，分别接种于C3, C3S和C3C培养基中，35度处理2天后置28度培养箱中，7天后调查花药污染率，褐化率，花药膨大率。2结果与分析表1 抗生素对花生组培中细菌的抑制作用Table 1 The inhibitory effect of antibiotics on the bacteria in the tissue culture of 抗生素 Antibiotics 浓度mg/LConcentration 接种数个Inoculated number污染个数个Bacterianumber细菌污染率Bacteria pollution rate %对照0503774.00氨苄青霉素Penicillin sodium30301860.0060371232.4312041819.51利福平Rifampicin30241354.1760311135.4812020525卡那霉素Kanamycin sulfate3022627.276042716.671202100盐酸四环素Tetracycline Hydrochloride3011436.366014321.4312023417.39羧卞青霉素Carbenicilin Disodiun302727.416030001201700表2花生组培苗在不同抗生素处理中的叶、茎测定结果抗生素 Antibiotics 浓度mg/LConcentration 平均茎高cm平均叶片数个生长情况对照01.887.1氨苄青霉素Penicillin sodium301.846.8叶片稍小601.736.71201.706.3利福平Rifampicin301.816.3叶片变黄变小601.736.41201.676.2卡那霉素Kanamycin sulfate301.676.8叶片变黄变小601.646.51201.616.6盐酸四环素Tetracycline Hydrochloride301.726.5叶片变小601.736.21201.746.4羧卞青霉素Carbenicilin Disodiun301.716.7叶片变小601.606.41201.536.62. 1抗生素对组培苗培养基的抑菌效果实验结果表明（表1）, 添加抗生素的培养基处理中,抑菌效果都有显著增强，抗生素浓度越高，污染率越低。其中以羧卞青霉素的处理表现最好，30mgL浓度处理的污染率仅为7.41，60 mgL和120mgL浓度处理的培养基均无任何细菌性侵染。 而未加抗生素的处理中细菌性侵染, 污染率为74%。说明在培养基中添加抗生素可有效抑制细菌侵染。2. 2不同抗生素对花生试管苗生长的影响从实验结果(表2) 可以看出, 花生试管苗的平均株高、平均叶片数在添加抗生素的培养基的处理中与对照均无显著差异, 但叶片普遍明显变小变黄，尤其添加卡那霉素和利福平的处理叶片普遍发黄，叶绿素的合成明显受到影响。表明添加的这几种抗生素对组培苗的生长都有一定影响,而添加卡那霉素和利福平的处理对组培苗的叶绿素的合成有抑制作用。总数污染总数污染率3d后褐化率膨大率C3-T07621276345648538C3S-T07624315878415405C3C-T0762836849375100C3-T1289321470463523C3S-3C-T1508 1663076137C3-T25611196452575086C3S-T25219365482616615C3C-T255112578427296C3-T345184080637438C3S-T3591322037556994C3C-T35626466353367143C3-T44920408261199667C3S-T4488166764925147C3C-T4481837590636696C3-T55925423761796607C3S-T55617303651615468C3C-T56117278747635532C3-T67940295166526965C3S-T64811229293186023C3C-T6722129178724702. 3 花蕾用抗生素浸泡处理的抑菌效果实验结果表明（图）无抗生素浸泡的T0对照在三种培养基的污染率为2763；3158； 3684。T1处理表现最好污染率为32.14；0；16.而T2T6虽然有些处理污染率有下降，但优势不明显，并且有些处理污染率反而上升。T6按说抗生素浓度最高，抑菌效果应该比其它处理要好，但实验结果并没有显现出好的抑菌效果。这说明用抗生素浸泡花蕾，并没有达到理想的抑菌效果。2. 4 花药培养基中添加抗生素的抑菌效果实验结果表明（图）与对照C3相比，添加了60mg/L链霉素的C3S培养基抑菌效果较明显，而添加了60mg/L 羧苄青霉素的C3C培养基抑菌效果不明显。2. 5 抗生素对花药培养褐化率的影响实验结果表明（图）用抗生素处理的花药无论是在C3S培养基中还是在C3C培养基中，花药的褐化率都有上升，说明在培养基中添加抗生素对花药生长发育有负面影响。而用抗生素浸泡处理的花蕾，在C3培养基中随浸泡的抗生素浓度的升高褐化率也有所升高，说明在添加了抗生素的溶液中浸泡，对花药的生长发育也有一定的负面影响。2. 6 抗生素对花药培养膨大率的影响实验结果表明（图）在培养基中添加抗生素对花药膨大率的影响不大，但用抗生素浸泡处理的T1T6在C3培养基中的膨大率有明显变化，而在C3S和C3C培养基中，膨大率没有明显变化。原因可能是接种的花蕾大小对膨大率有影响，所以导致这种现象发生。3结论3. 1实验结果表明, 在在花生组织培养苗继代培养基中添加一定浓度的医用抗生素可有效抑制细菌对培养基的侵染。在本实验所选用的5 种抗生素中, 羧卞青霉素对污染的组培苗抑菌效果最显著，60mg/L就能达到抑菌率100，并且对组培苗的正常生长无显著影响, 在花生组培中可以选用。 而添加卡那霉素和利福平的处理，组培苗的叶绿素的合成明显受到影响，不建议选用。3. 2抗生素的浓度对植物试管苗的生长发育有一定影响, 低浓度抑菌效果不理想，浓度月高抑菌效果越好, 但高浓度却抑制了组培苗的生长; 当浓度控制在60mg/L左右时, 完全可以抑制组培苗的细菌性侵染,预防组培苗的大批污染, 且对花生组培苗的生长发育不良影响小, 对花生组培苗的保存有很高的利用价值。3. 3 抗生素虽然在抑制花生组培苗的细菌侵染有显著作用，但是用单一抗生素抑菌,易产生抗药性,一旦停止使用,污染率又显著上升。3. 4 抗生素的菌谱不一,尚没有一种抗生素对所有的细菌都有效,在细菌种类繁多的状况下，抑菌效果不显著。在花药培养中的抑菌效果就不明显。并且抗生素对花药的生长发育有负面影响，褐化率明显上升，膨大率也有所下降。参考文献: 1 王镜岩,朱圣庚,徐长法. 生物化学M . 北京:高等教育出版社, 2002. 1 曹孜义, 刘国民. 实用植物组织培养技术教程M . 兰州: 甘肃科学技术出版社. 20011283 301.(本文责编: 刘润萍)_ 3 李春燕,李颖. 组织培养中青霉素对细菌污染的控制作用 J . 东北林业大学学报, 2000, 28 (5) : 9798. 4 朱广廉. 植物组织培养中的外植体灭菌 J . 植物生理学通讯, 1996, 32 (6) : 444449. 5 周俊辉,刘花全,罗慧君,谢海佳,黄树行. 玛丽安万年青茎段培养的污染防止 J . 仲恺农业技术学院学报, 2002, 15(4) : 4348. 6 Singh H P, Sanjay Singh, Saxena R P, et al. Pretreatment ofnodal segments for in vitro establishment and bud activation ofMadhuca latifolia J . Plant Physiology and Biochemistry NewDelhi, 1992, 19 (2) : 116122. 7 张桂芳,贺红. 广佛手组织培养中的污染及防治研究 J .中医药学刊, 2005, 23 (2) : 296. 8 王春. 医用抗生素在马铃薯组织培养中的抑菌效应研究 J . 甘肃农业科技2004, (10) : 1516. 9 韩美丽,陆荣生,黄华艳,等. 绿巨人组培苗继代过程中玻璃化苗及细菌污染的消除方法研究 J . 广西林业科学研究,1999, 28 (1) : 1619. 10 王亦菲,陆瑞菊,周润梅,等. 彩色海芋组织培养过程中内生菌的抑制 J . 上海农业学报, 2001, 17 (2) : 8283. 11 Bistrichanov S, Haralamp ieva V, Kaloyanova N. Testing of dif2ferent types of antibiotics against bacterial contamination inHydrangea hortensis in vitro J . B