以固定化菌體生物觸媒生產生質柴油的生化程序研究.doc

張淑青 陳志平 以固定化菌體生物觸媒生產生質柴油的生化程序研究以固定化菌體生物觸媒生產生質柴油的生化程序研究張淑青 陳志平長庚大學 化工與材料工程研究所/生化與生醫工程研究所第七屆生化工程研討會論文集1. 簡介近年來，由於石油價格的飆漲，及其來源的縮減，以及對環境的負面影響，逐漸發展出由植物油或動物脂肪與短鏈醇類進行交酯化生產生質柴油。大量使用石油的結果，造成空氣污染急遽嚴重，其生成的CO2氣體更是地球溫室效應的最大殺手。硫化物及鹵化物亦是人類致癌的主因。利用脂肪分解酵素(lipase)以甲醇交酯化植物油，所生成的甲基酯(methyl esters)即是所謂的生質柴油。不但大大降低污染問題，並且解決了燃燒時所產生的煤煙公害。_陳志平 長庚大學生化與生醫工程研究所教授Tel: (03) 3283016轉5295E-mail: .tw張淑青 長庚大學化工與材料工程研究所學生利用酵素的特異性，我們可以成功的將植物油與甲醇酯化生產柴油中主要成份的甲基酯類，但在此之前，我們必須找出酵素活性最高、降低經濟成本並有助於進行酯化的最佳反應條件。本研究將利用黴菌菌絲體內之脂肪分解酵素進行交酯化反應，探討菌體培養時間、菌體處理方法、最適化反應條件，及固定化菌體與自由菌體酯化反應之差異性。2. 材料與方法2.1菌種及培養基實驗所使用菌種為Rhizopus arrhizus。固態培養基成份分別為300 g dices potatoes，20 g glucose， 15 g agar，1 L distilled water。液態培養基成份分別為5% corn-steep liquor，2% olive oil， 0.2% KH2PO4，0.05% KCl，0.05% NaNO3，0.05% MgSO47H2O，(all w/v)，pH=4.6。2.2前培養利用接種環沾取已在平面培養基上生成的菌絲，再均勻塗佈於斜面培養基上，約72 小時之後，將斜面培養基上生長出來的菌體以些微無菌水沖出，並將此液體取10 L接種於內含100 mL液態培養基的500 mL震盪搖瓶，接種的孢子數濃度控制在26106 spores/L之內。培養條件為溫度30，轉速150 rpm。2.3實驗方法將液態培養基中的菌體過濾回收，並以丙酮浸泡30分鐘，再將菌體置於30、真空狀態下烘乾48小時後秤重。取固定比例油與甲醇於20 mL反應瓶內，加入自由或固定化菌體放入30恆溫水槽中，以150 rpm震盪反應固定時間後，取出定量的反應液，再加入等體積的內標準品(tricaprylin)，並以hexane稀釋。以GC分析產量，以決定酯化反應的速率及轉化率。2.4GC分析條件分析管柱: J&W Scientific DB-5 (column length : 15 m; ID : 0.32 mm; film thickness: 0.25 m); 注射溫度: 270; 管柱溫度: 150保持0.5 min，再以10/min加熱至300，保持2 min; FID偵測器溫度: 250; 載流氣體: N2; 流速: 2 mL/min; 分流:30mL/min。3. 結果與討論3.1比較菌體在不同生物支持體上固定的情形基於菌體回收並再次利用的經濟效益為考量，我們將菌體固定在生物支持體上，即biomass support particles(BSPs)，並比較菌體在何種BSPs上固定的比較多。而由圖(一)得知，以單位體積BSPs上的菌量來比較，chitosan上的菌量達0.2543 g/3，而以每單位重量BSPs上的菌量來比較，polyurethane foam particle(PU111)上的菌量達1.1474 g/g BSP為最高。圖(一) 六種BSPs對菌體固定的影響3.2找出菌體在BSPs上的最高活性與轉化率我們已從圖(一)中得知BSPs上固定之菌體量，以這些BSPs上的菌體進行酯化反應，反應條件為油:醇=1:1.5 (mol)。再由GC分析得知活性最高為固定在PVF上的固定化菌體，其比活性為468 mM/h.g。其次為固定在不織布上的固定化菌體，其比活性為323 mM/h.g。圖(二) 六種BSP對固定化菌體活性之影響再由圖(三)中得知，經過24小時酯化反應後，不織布上的固定化菌體轉化率最高，其次為PVF上的固定化菌體。圖(三) 六種BSP對固定化菌體酯化反應之影響綜合圖(二)與圖(三)，我們找出兩種對於菌體固定化最有利之生物支持體，即不織布與PVF，再用這兩種固定化菌體與自由菌體比較其反應之優異性。3.3最佳活性及轉化率之生長條件接下來的實驗當中，我們將固定化菌體及自由菌體分別培養48、72、96、120小時，再進行酯化反應，反應條件為油:醇=1:1 (mol)。觀察其活性與轉化率，以作為我們判斷菌體收成的時間依據。由圖(四)、圖(五)、圖(六)菌體的培養時間與比活性之作圖，我們可以很清楚的看到，自由菌體在培養96小時，不織布與PVF在培養72小時時活性最高。其中又以PVF比活性最高，達381 mM/h.g。圖(四) 自由菌體培養時間對活性之影響圖(五)固定化菌體在不織布上培養時間對活性影響圖(六)固定化菌體在PVF上培養時間對活性影響由以上三個圖，我們得知，在培養自由菌體時，必須經過96小時，方能得到最高的酵素比活性。但在培養固定化菌體時，只要經72小時，就可得到最高的酵素比活性，故菌體固定化在酵素比活性的表現上可提前24小時，可大大提昇經濟效益，且固定化菌體之酵素活性大於自由菌體。3.4菌體固定在生物支持體上之型態我們可由圖(七)至(十)觀察菌體固定在生物支持體上之型態，其固定效果良好，菌體均能長滿整個生物支持體。菌體的密集性對於酯化反應的速率，具有相當的影響力。在之後的實驗中，我們也將證明固定化菌體的優點。圖(七) 培養前之polyurethane foam圖(八) 培養後之polyurethane foam圖(九) 培養前之PVF圖(十) 培養後之PVF3.5自由菌體與固定化菌體在相同條件下之酯化反應影響將自菌體與固定在不織布與PVF上之固定化菌體取大約0.2 g，油與甲醇比例為1:1 (mol)，在30恆溫水槽，轉速為150 rpm下震盪24小時之後，觀察其活性及轉化率。圖(十一) 自由菌體與固定化菌體對活性與轉化率影響由圖(十一)我們可以得知固定化菌體在24小時的轉化率遠遠超過自由菌體的轉化率。這是由於生物支持體將菌體密集度增加，迫使菌體活性發揮，而使反應能夠在短時間內達到效應。固定化不但能達到快速的反應效率，對於菌體的回收，也是藉由生物支持體能將菌體緊緊捉牢，回收的成效自然就比自由菌體來的好。由此，我們可以證明固定化菌體的好處。3.6以有機溶劑處理自由菌體對活性之影響性在之前提及實驗方法的部分，我們將菌體回收之後，再以有機溶劑(丙酮)處理。這是由於酯化反應中，我們必須藉由菌體內的脂肪分解酵素，催化反應的進行。而脂肪分解酵素乃存於菌體內部，因此才必須藉助有機溶劑，將菌體細胞膜破壞，如此一來，反應液將容易進入菌體之內，與酵素產生催化作用生成產品。在此實驗中，我們針對四種有機溶劑(acetone、methanol、ethanol、isopropanol)處理過後之自由菌體做酯化反應，比較其活性。如圖(十二)所示，以四種不同有機溶劑處理過後之自由菌體，以丙酮處理過的菌體活性最高。這表示丙酮能將菌體適度破壞，而使質傳問題降到最低。圖(十二) 以四種有機溶劑處理自由菌體之活性影響3.7改變反應時油與甲醇的比例關係反應液為油與甲醇所組成，其比例關係是否對轉化率有所影響，我們也將在此做探討。圖(十三) 油與醇比例對酯化反應影響由圖(十三)我們得知當油與甲醇比例為1:0.5及1:1(mol)條件下，在24小時反應過後，轉化率達100 %，比其他油與醇的比例高出許多。這是由於短鏈醇中的-OH基會抑制反應的進行，導致反應進行緩慢。所以我們可以由油與醇比例的調控，加速酵素催化反應，節省反應時間。4. 結論根據上述自由或固定化菌體交酯化實驗結果，證明了固定化菌體活性比自由菌體表現佳。且固定化菌體在培養72小時即能得到高的酵素活性，比自由菌體必須培養96小時才能得到高的酵素活性，其經濟成本大幅降低。回收後的菌體以有機溶劑(丙酮)破壞菌體細胞膜，即能降低反應液及脂肪分解酵素反應質傳問題。在油與甲醇比例的調控上，可採取反應進行不會被-OH基所抑制的條件以1:0.5或1:1 (mol)為考量， 在找出反應最佳化條件後，進而考慮回收及再使用的問題，將是下一步研究計劃的重點。5. 參考文獻1.K . Ban, M . Kaieda, T. Matsumoto, A. Kondo,H. Fukuda, whole cell biocatalyst for biodiesel Fuel production utilizing Rhizopus oryzae cells immobilizes within biomass support particles, Biochemical Engineering Journal, 8, (2001), 39-43.2.Y. Shimada, M. Kaieda, T. Matsumoto, K. Ban, T. Samukawa, A. Kondo, H. Noda, H. Fukuda, Pretreatment of immobilized Candida antarticaLipase for biodiesel fuel production from plant oil, Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, (200