生物化学和分子生物学4.ppt

基因与基因组测序 是遗传信息的物理和功能单位 包含产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列 基因分类 编码RNA的基因 如rRNA基因 snRNA基因等 编码蛋白质的基因 什么是基因 什么是基因组 基因组就是一个物种中所有基因的整体组成 基因组有两层意义 遗传物质和遗传信息 要揭开生命的奥秘 就需要从整体水平研究基因的存在 基因的结构与功能 基因之间的相互关系 Homosapiens3 000Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana100Saccharomycescerevisiae12E coli4 6 基因组大小 Mb 目前已经测序的生物基因组数量已经超过1000 关于第一个完成测序的物种还是有共识 那就是噬菌体PhiX174 这个工作在1977就已经完成了 18年后的1995 当科学界翘首期盼基因组最小的微生物 生殖支原体 Mycoplasmagenitalium 的基因组测序结果时候 7月28日Science杂志发表了基因组数量3倍于生殖支原体的流感嗜血杆菌的基因组 这是人类成功地完成的第一例可以独立生存生物的基因组 开启了现代基因组学的新纪元 时隔3月后 生殖支原体的基因组才告完成 一些主要模式生物基因组研究概况 1995年7月 第一个基因组 流感嗜血杆菌 Haemophilusinfluenzae 的全序列发表 大小为1 8Mb 1996年10月 酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae 的基因组全部测序完成 1997年9月 大肠杆菌 Escherichiacoli 基因组全部测序完成 全长5Mb 2001年12月 线虫 Caenorhabditiselegans 基因组测序完成 一些主要模式生物基因组研究概况 2000年 3月 Celera公司完成果蝇 Drosophilamelanogaster 基因组 180Mb 的全部测序工作 在当时所有已测序的基因组中是最大的 同时这也证明了 全基因组鸟枪法 的可行性 2000年12月 第一个植物基因组 拟南芥 Arabidopsisthaliana 基因组被全部测序 大小为125Mb 水稻的基因组 2002年我国科学家完成了水稻基因组定序和初步分析 出人意表的是 水稻的基因竟比人类基因还要多得多 人类基因大约有3 4万个 水稻有46022 55615个基因 因此水稻基因组可说是继人类基因组之后 完成定序的最大基因组 也是至今已知最大的植物基因组 由于水稻是全球半数以上人口的主食 对解决全球粮食问题具有重要意义 浩大繁芜的水稻 基因天书 在2005年终于完成了 终结篇 2005年出版的英国 自然 杂志 刊登了一张迄今为止最精确 完整的水稻全基因组序列完成图 它宣告 这一历时6年半的国际大科学工程圆满结束 值得一提的是 在上海和台湾科学家的共同努力下 我国对国际水稻基因组计划的贡献率达20 写下了绚烂的 中国卷 这是继人类基因组计划之后 科学家完成的又一项重要测序工作 而且比原计划提前3年完成 项目协调人 日本科学家佐佐木卓治兴奋地介绍 科研人员总共定位了水稻中37500个基因 相比3年前的 草图 新绘制的 精细图 覆盖率达到95 3 误差率不超过万分之一 并首次在高等动植物中完成了对着丝粒的测序 水稻总共有12条染色体 其中蕴藏着高产优质 美味色香以及与抗病抗虫 抗逆等性状相关的遗传信息 在此次国际分工中 以中科院上海生命科学研究院国家基因研究中心为首的项目组负责第4号染色体精确测序任务 位于我国台湾的 中央研究院 植物研究所则揽下了第5条 水稻的基因组 1998 2测序工程启动 2002 11中国 日本率先完成水稻第4号和第1号染色体的序列精确测定 并在英国 自然 杂志上发表了有关成果 2002 12水稻基因组 草图 绘就 2003 6美国科学家完成了水稻第10号染色体的序列精确测定 研究结果发表在美国 科学 杂志上 2004 12水稻基因组 精细图 全部完成 2005 8 精细图 刊登于 自然 杂志上 水稻的基因组 人类基因组计划 人类基因组计划 Humangenomeproject 于1990年启动 我国于1999年加入该计划 承担其中1 的任务 即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务 人类基因组计划的目的 阐明人类基因组30亿个碱基对的序列 发现所有人类基因 并搞清其在染色体上的位置 破译人类全部遗传信息 使人类第一次在分子水平上全面地认识自我 解码生命 了解生命的起源 了解生命体生长发育的规律 认识种属之间和个体之间存在差异的起因 认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象 为疾病的诊治提供科学依据 人类基因组计划HumanGenomeProject TheHumanGenome 23染色体3 2x109碱基对 3 200 000 000 5 mRNA 30 000genes 3 翻译成蛋白 Exon1 Exon2 Exonn protein codingregion gene 基因组 指的是生物体内的所有DNA 包括它的基因 人类基因组计划要测定的是人体23对染色体中的所有DNA的序列 它由31 647亿个碱基对组成 共有3万至3 5万个基因 换句话说 生命天书是由30多亿个字写成的 如果将这30多亿字排版到一张报纸上 那么大约需要20万页纸才能排完这部巨著 由此可以想见 读取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人 解读生命的 天书 人类基因组计划 人类基因组计划的意义 随着人类基因组逐渐被破译 一张生命之图将被绘就 人们的生活也将发生巨大变化 人类基因研究的意义在于它可以支持和推动生命科学中一系列重要的基础性研究 如基因组遗传语言的破译 基因的结构与功能关系 生命的起源和进化 细胞发育 生产 分化的分子机理 疾病发生的机理等 Strategies randomshotgun HUGO wholegenomeshotgun Celera 两种策略的比较 鸟枪法策略指导测序策略不需背景信息构建克隆群 遗传 物理图谱 时间短需要几年的时间需要大型计算机得到的是草图 Draft 得到精细图谱 RandomShotgun Genomiclibraryproduction wholegenome 3 200 000kb partiallydigestedDNA sizing 100 500kb BAClibraries Adaptedfrom BaylorCollegeofMedicine HumanGenomeSequencingCenter Mapping pieces 100 500kb Mapping MARKERS MARKERS sequencetaggedsites STS restrictionsitepatternknowngenes MappingofBAC YACClones mappedBACclone 100 500kb shearedDNA 1 0 2 0kb sequencingtemplates randomreads 0 6 1kb Adaptedfrom BaylorCollegeofMedicine HumanGenomeSequencingCenter RandomShotgun Sequencing randomphase Celera WholeGenomeShotgunSequencing wholegenome 3 200 000kb shearedDNA 1 0 2 0kb sequencingtemplates Adaptedfrom BaylorCollegeofMedicine HumanGenomeSequencingCenter randomreads 0 6 1kb ShotgunSequencing Assembly both Consensus sequence gap lowbasequality singlestrandedregion mis assembly inverted Adaptedfrom BaylorCollegeofMedicine HumanGenomeSequencingCenter draftquality ShotgunSequencing Finishing both Adaptedfrom BaylorCollegeofMedicine HumanGenomeSequencingCenter finishedquality DNA测序的方法化学降解法测序链终止法测序自动化测序非常规DNA测序 Watson Crick FranklinmolecularstructureofDNA1976Maxam GilbertDNAsequencingviachemicaldegradation1977SangerDNAsequencingviachaintermination1986Hood AnsorgeautomatedDNAsequencingwith dyeprimer 1989Murray cyclesequencing withTaqpolymerase1991NEN DuPONT dyeterminator sequencing1999ABI MD96wellcapillarysequencer MilestonesofDNASequencing 杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法流式细胞仪测序法大规模平行实测法 DNA芯片法 DNA测序方法 经典方法 新技术方法 Maxam GilbertDNA化学降解法 Maxam和Gilbert 1977 Sanger双脱氧链终止法 Sanger和Coulson1977 HowDNASequenceIsDetermined PolyacrylamideGelElectrophoresis TAGC T A C G DNAfragmentshavingadifferenceofonenucleotidecanbeseparatedongelelectrophoresis Butthesebandscan ttellustheidentityoftheterminalnucleotides Ifthosebandwiththesameterminalnucleotidecanbegrouped thenitispossibletoreadthewholesequence 生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸 每组寡核苷酸都有固定的起点 但却随机终止于特定的一种或者多种残基上 由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等 因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物 这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定 在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下 对各组寡核苷酸进行电泳分析 只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上 即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序 方法概述 核酸序列分析的经典方法 化学法 化学裂解法 Maxam Gillbert法 酶法 DNA链的末端合成终止法 sanger法 HowtoObtainDNAFragments AT ATCGAT SpecificReactiontoG STOP A Terminated Biosyntheticmethod Chemicalmethod Template or Non radioactive invisible Producingvariousfragments JuangRH 2004 BCbasics 化学裂解法 Maxam Gillbert法 基本原理 基于某些化学试剂可以使DNA链在1种或2种碱基处发生专一性断裂的特性 精确地控制反应强度 使一个断裂点仅存在于少数分子中 不同分子在不同位点断裂 从而获得一系列大小不同的DNA片段 将这些片段经电泳分离 分析前 用同位素标记DNA的5 末端 用4组不同的特异反应 就可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段 其末端都是该特异的碱基 经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱 Maxam Gilbert法所用的化学技术 Maxam Gilbert化学降解测序法 先用限制性内切酶把DNA切成10 200bp的测序材料 用碱性磷酸化酶处理该片段 消除5 末端上的磷酸 在5 OH端标记32P 用多核苷酸磷酸激酶催化 标记片段变性为单链 化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA 产生一组长度不等的DNA片段 DNA的化学测序示意图 DNA的化学测序示意图 反应试剂G反应 硫酸二甲酯G A反应 甲酸T C反应 肼C反应 NaCl 肼 Maxam Gilbert化学降解测序法 化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA 产生一组长度不等的DNA片段 经电泳和放射性自显影后 从4个反应系统统一阅读 待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出 Maxam Gilbert化学降解测序法不需要进行酶催化反应 因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差 对未经克隆的DNA片段可以直接测序 化学降解测序法特别适用于测定含有如5 甲基腺嘌呤A或者G C含量较高的DNA片段 以及短链的寡核苷酸片段的序列 测定的长度短 如裂解位点的统计学分布等等 Advantages Disadvantages Sanger的酶降解测序法 链终止法 这项技术的关键是在DNA的聚合过程中依赖特殊反应底物 2 3 双脱氧核苷三磷酸ddNTP 的特异性终止进行DNA测序 DNAreplication biochemistry O C N purineorpyrimidine HO P O O OH O O C N purineorpyrimidine OH 5 3 2 3 ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3 位置缺少一个羟基 它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中 但由于没有3 羟基 它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链 因此 正在增长的DNA链不可能继续延伸 酶法序列分析的原理 酶反应 DNA聚合酶 Klenow 电泳方向 5 3 标记引物 dATPdCTPdGTPdTTP ddATP dATPdCTPdGTPdTTP ddTTP dATPdCTPdGTPdTTP ddGTP dATPdCTPdGTPdTTP ddCTP GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCGTTG GGCCATCG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT ACGT GGCCATCGTTGA GGCCATCGT GGCCATCGTTG GGCCATCGTT GGCCATCG GGCCATC GGCCA GGCCAT GGCC GGC 荧光标记物 ddGTP ddATP ddTTP ddCTP 计算机排序 5 后人类基因组计划 伴随着人类基因组计划的迅速进展 基因的全序列逐步被完整的测出 会出现大量的不知道任何功能信息的序列 因此 在HGP完成之后 即全部人类基因被定序之后 还需要 破解贮存于基因组之中的遗传语言 识别 分离 鉴定和克隆所有基因 搞清每个基因的功能及基因之间的相互作用和相互关系 人类后基因组时代 Post genomeera 从DNA到蛋白质 2000年是基因组之年 完成了人类基因组的工作框架图 完成了一系列模式生物和微生物的基因组序列分析 人类后基因组时代的特点 人类首次了解了自身的基因序列 了解了很多远亲生物的基因序列人类正在面对指数扩增的基因序列资料和各种数据库人类面临的挑战是如何将基因序列资料转变为有用的知识 进而让这些知识服务于人类 使之能够造福于人类的健康 前基因组时代的 钓鱼 和后基因组时代的 捞鱼 后基因组时代研究的重要方向 1 单基因遗传病的致病基因研究和基因诊断我国有丰富的疾病资源 特别是一些我国特有的单基因遗传病家系 可提供良好的基础发现新的致病基因 2 复杂性疾病的相关基因研究和疾病易感性分析在复杂性疾病的中 由于基因的变异加环境和生活习惯等因素的共同影响 使得每个人对不同的疾病的易感性不同 3 药物基因组学研究与个体化治疗在临床上对同样一种疾病使用同一种药物 不同的个体对药物的敏感性和毒性反应有很大的区别 这种区别主要由基因决定的 特别是药物靶点基因 药物代谢基因等的单核苷酸多态性 影响了药物作用的强弱和药物代谢的不同 疾病诊断 药物1 药物2 药物3 疾病诊断 药物1 药物2 药物3 药物敏感性测定 目前的疾病治疗 将来的疾病治疗 4 人类功能基因组学研究以全基因组为背景 开展人类基因及其编码蛋白的功能研究 目前虽然完成了绝大部分基因的序列分析 但约60 的人类基因的功能未知 目前认为人类有3 2万个基因 其中1 5万已知功能 1 7万未知功能 人类功能基因组 计算机科学家 生物化学家 细胞生物学家 结构生物学家 生理学家 遗传学家 临床和病理学家 5 基于基因组的新型药物 Genome baseddrug 利用反向生物学原理 根据人类基因序列数据 经生物信息学分析 高通量基因表达 高通量功能筛选和体内外药效研究开发得到的新药候选物 人类基因序列 生物信息学 重组蛋白质表达 高通量生物活性筛选 功能研究 药物靶标研究 先导化合物筛选 基因工程药物开发 化学新药 基因组药物开发流程 蛋白质序列 基因治疗 人类基因组与生物技术产业 一个人类基因有可能带动和形成一个生物技术产业 例如基因工程的胰岛素 干扰素等基因的开发研究基因组药物 基因芯片 基因诊断 基因治疗 实验室仪器试剂 基因数据库和分析软件等 人类基因组为药物开发提供了新源泉迄今已应用的人类药物靶标约500种 包括受体 酶 信号转导分子等 开发成功的药物约2000种 估计人类基因组中3 4万个基因中 约5000个基因产物可成为潜在的药物靶标 基因组药物的种类 1 基因工程重组蛋白质药物2 以人类基因编码蛋白为靶标的化学药物3 以人类基因编码蛋白为靶标的人源化抗体4 反义核酸类和RNA类药物5 基因治疗 国际新药开发的三个浪潮 基因组学药物靶标发现 反义治疗 基因治疗蛋白质组学药物靶标评价 药物筛选 抗体治疗 重组蛋白质治疗分子设计蛋白质结构确定 蛋