流式细胞术的原理和临床讲解材料课件

流式细胞术在细胞生物学中的应用 一 细胞周期分析细胞周期分为DNA合成准备期 G1 DNA合成期 S期 分裂准备期 G2 以及分裂期 M期 此外 如细胞停止增殖称为静止期 G0 期 由于DNA在各期中不同 可以确定G1 G0 S G2 M各期的百分比 使用特定荧光染料如PI对细胞的DNA染色 用流式细胞仪分析细胞中DNA的含量 溴脱氧脲嘧啶核苷替代胸腺嘧啶脱氧核苷参与DNA的合成 测定DNA的合成速率 异染性荧光染料AO 同染DNA RNA识别G0 G1期 二 测定细胞周期蛋白 癌基因及抗癌基因蛋白对细胞周期调节机理研究进展较快 真核细胞的增殖是控制在细胞周期的特定阶段 特别是在G1到S期以及G2到M期移行部位 Cyclin 周期蛋白 作为Cyclin依赖性cdk复合体的调节亚单位 对细胞周期起重要的调节作用 Cyclin家族中有8种CyclinA B C D E F J H CyclinA B F及E在细胞周期中不间断的表达 这些蛋白质合成及降解构成了细胞周期的特征性 增殖细胞核抗原PCNA是一稳定的细胞周期相关性核蛋白 在G1期和S早期 PCNA水平升高2 3倍 在G2期保持低值 Ki 67核抗原可见细胞周期全过程 而静止期G0无表达 C erB 2 产物是分子量为190KD跨膜糖蛋白 其结构类似于表皮生长因子受体 过表达C erb常常与肿瘤细胞较快增生及病人预后有关 使用FCM可测定C erb 2在乳腺癌等中的表达 并可进而分析与病人预后的关系 MYC基因家族由C MYC N MYC及L MYC构成 也是与细胞增殖有关的癌基因 最近的研究提示MYC基因与凋亡的诱导有关 P53已被认为是一种抗癌基因 野生型P53蛋白是一种细胞生长抑制物 能阻断细胞周期循环 人类的许多恶性肿瘤中 可见P53突变 用FCM可以测定P53在癌细胞内表达 从而评估诊断和预后 P53TumourSuppressorGene Humanp53Protein AntibodyMappingSites 四 细胞凋亡研究上的应用细胞死亡在多细胞生物通过两种机理而产生 即凋亡和坏死 凋亡不仅与个体形成等基本生命现象有关 而且与癌 AIDS等多种疾病的发生密切相关 电泳分析可见DNA呈阶梯状改变 使用FCM能精确定量凋亡细胞 同时可进行多参数分析 原位标记DNA断裂的方法已用来鉴别凋亡的细胞 使用生物素或地高辛标记的脱氧核苷酸在外源性DNA聚合酶或TdT作用下 标记3 OH 荧光素标记的二抗与其结合 用流式细胞术检测凋亡细胞 凋亡蛋白的检测 反映细胞凋亡的早期蛋白AnnexitV其他P53蛋白 Myc蛋白 bcl 2蛋白 Bax蛋白等等 五 多药耐药检测近年来的研究发现癌细胞耐药性与癌细胞内存在耐药基因有关 多药耐药基因 multidrugresistantgene MDR 的产物为P 糖蛋白 P GP或P 170 P 170是分子量为170KD的跨膜蛋白 利用ATP的能量将抗癌药物排出细胞外 除在正常细胞上表达外 常常在许多实体肿瘤细胞及白血病中高表达 提示耐药性增高 故对于肿瘤化疗病人 检测P 170有重要的临床意义 可指导癌症治疗 用抗P 170抗体标记肿瘤细胞 用流式细胞术可直接测定P 170表达 也可用罗丹明荧光染料作为被测抗癌药物在细胞中的积聚 在耐药细胞有P 170糖蛋白的过表达 使进入细胞的罗丹明荧光染料可以被泵出细胞外 细胞内的罗丹明减少 荧光强度降低 可以用FCM检测 流式细胞术在免疫学中的应用 一 细胞表面标记及抗原决定簇性质的研究流式细胞术在细胞表面标记 特别是肿瘤细胞表面标记的研究中 以及在细胞分类和亚群的分析上 开始了一场细胞免疫学的革命 尤其在细胞表面标记分析上 占有举足轻重的地位 1 1血液系统细胞表面标记的研究可用于白血病细胞的免疫分型和淋巴瘤的研究 1 2细胞群体及细胞表面标记变化的检测可以发现体内外细胞表型及细胞亚群的微小变化 有利于发现恶变的肿瘤细胞 或在免疫治疗及宿主排异反应中抗原决定簇发生改变的细胞群体 1 3细胞表面抗原决定簇性质研究1 4细胞表面标记的分子变化的定量分析1 5细胞抗原表达的研究 细胞抗原的表达和细胞的其他生物和生化变化一样 是细胞增殖和增殖活动中的一种现象 研究正常和肿瘤细胞增殖 分化及周期活动中抗原表达 对于加深对肿瘤发生 发展 肿瘤细胞及肿瘤实体的异质性 肿瘤入侵转移的认识和它们同肿瘤诊治 耐药性的认识是十分重要的 一 临床免疫学中的应用1 机体免疫状态评估就用FCM及荧光染料标记的特导性单克隆抗体 可对细胞表面标记物进行研究 结合细胞分选技术 将分选同鉴定结合进行 可分离出所需的细胞群体 纯度可达95 以上 现在命名的CD系列已有130种细胞表面分化抗原 可分选 分析出外周血细胞 亚群及亚群中的亚群 也可以对循环免疫复合物及其它免疫指标检测 例如 HLA B27检测 其抗原阳性与强直性脊柱炎及炎症性肠病等有不同程度的正相关 用于免疫细胞表型分析的基本抗体 1 1免疫缺陷病它是由于机体免疫系统先天发育不全或后天受损所致的一种临床综合症 用FCM行T细胞表型分析大多数可用于分类诊断先天性或获得性的免疫缺陷综合症 如大多数伴严重联合免疫缺陷 SCID 的患者血中缺乏成熟的T细胞 个别病例血中有循环T细胞 但表型异常 AIDS 大多数有明显的T4 T8降低 应用FCM行T4 T8细胞计数及T4 T8比值测定 可作为排除诊断的方法 1 2感染免疫防御的作用之一是抗感染作用 用FCM分类计数功能 可监测不同感染中淋巴细胞的变化 例如 疱疹病毒感染的特点是 T8 的细胞数目和比例增高 有时可见T8表面有DR抗原 另外 在细菌感染中可有T4 T8增高 1 3肿瘤一般认为机体免疫低不是肿瘤的始动因素 而细胞一旦发生癌变 机体免疫系统即对癌细胞产生应答 其结果是消灭肿瘤细胞 终止肿瘤的发展 应用FCM可检测肿瘤相关抗原 并可对DNA RNA的变化及淋巴细胞分类进行监测 对肿瘤起至监测 预后评估的作用 1 3 1淋巴瘤 白血病 可以协助确定细胞来源 协助临床诊断和治疗 1 3 2其它肿瘤 利用一些特异性的标记物 可以帮助肿瘤的早期诊断和治疗 总之 利用FCM检测表面抗原 细胞内的DNA RNA含量可以发现恶变的肿瘤细胞 另外应用FCM研究正常和肿瘤细胞增殖 分化及周期活动中抗原的表达 对认识肿瘤发生 发展 瘤细胞及肿瘤的异质性 肿瘤转移 诊断 治疗 药物耐药性的关系有重要意义 从而可用于临床肿瘤治疗中的临测 用药指导及预后评估 1 4自身免疫疾病自身免疫疾病的根本病因是自身成分具有抗原性和自身耐受性的破坏 用FCM对淋巴细胞亚群分类计数 测定循环免疫复合物及某些免疫指标 从而监测和诊断自身免疫性疾病 1 4免疫抑制剂和免疫增强剂二者均可对免疫系统进行调节 引起相应的免疫细胞水平的变化 前者常用的是 糖皮质激素 CTX 硫唑嘌呤等 后者常用的是 卡介苗 左旋咪唑等 用FCM可检测到用药后免疫细胞的变化 如 糖皮质激素可降低T4 水平 从而可用于疾病急性期限 环磷酰胺开始用时对T细胞影响小 2月后则出现T8 细胞增高 所以应用FCM可通过免疫监测来指导用药 在不产生药物副作用的情况下发挥药物的最大作用 2 器官移植中的作用2 1移植前监测FCM在移植前配型中有重要作用 其重要性在于抗体检测的特异性 敏感性和检测结果与移植结果的一致性 用它不仅可以检测ABO抗原抗体 还可检测抗HLAI和II类抗原抗体 保证了供 受体ABO及HLA的基本一致性 2 2移植后监测FCM在监测移植后免疫状态变化及免疫抑制剂 全身免疫抑制剂过程是必不可少的有效手段 另外还可以检测抗异体蛋白 如 抗淋巴细胞IgG及用于免疫抑制的Mabs抗体的出现及特异性 从而对是否发生免疫排斥及急性早期排斥有一定意义 2 2临床应用2 3 1肾 现已将T细胞亚群分析作为监测同种异体肾移植受者免疫状态的一种方法 骨髓 FCM的细胞表型分析使免疫重建的监测和对新生的免疫生物学状态的了解成为可能 3 免疫治疗 许多疾病与免疫系统功能发生障碍有关 而某些疾病则是在病程中出现能变化 3 1FK 506及天花粉蛋白两者均为高效免疫抑制剂 已用于临床 用FCM通过监测人的免疫水平来判断疗效并调整药物及用量 3 2IL 2它是免疫系统中重要的细胞因子 用FCM检测可发现 IL 2在离体时可诱导来源HIV患者外周血的单核细胞增生分化 发现IL 2治疗可使CD4细胞提高 50 故可周期性地用于HIV患者 3 3肿瘤免疫治疗近年来有了很大的进步 例如用IL 2活化的LAK细胞治疗肾癌 黑色素瘤 直肠癌等有一定疗效 用FCM可以估计治疗前后淋巴细胞亚群的变化以及活化状态 并判断免疫治疗的有效性 3 4移植免疫治疗目前临床移植配型以血清和细胞学为主 基因配型亦有发展 FCM移植配型的临床重要性在于抗体检测的特异性 敏感性以及结果和移植结果的相关一致性 FCM在监测移植后免疫状态变化和免疫抑制剂的疗效评估中是一项不可缺少的有效手段 流式细胞术在肿瘤学中的应用 一 肿瘤诊断包括监测癌前期病变 肿瘤早期诊断 交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面 DNA非整倍体的出现可能是癌变的一个重要标志 细胞的增殖能力大小也可反映肿瘤的生物学特性 因此 临床上可利用流式细胞术进行细胞周期分析和DNA倍体分析 辅助肿瘤诊断 一 肿瘤预后估计在病理组织学分级 临床分期等指标基础上 肿瘤DNA倍体可更客观地预测预后 通常 异倍体肿瘤恶性度 复发率 转移率 死亡率都较二倍体肿瘤要高 已有文献报道 在乳腺 结肠 直肠 前列腺和膀胱肿瘤中 异倍体和 或较高的S期百分比都是不良预后的标志 同样地 在肺 头颈部 卵巢 肾细胞 子宫内膜癌 黑色素瘤 非何杰金淋巴瘤和各种白血病中 亦有类似发现 流式细胞仪可以通过特异性的单抗监测肿瘤细胞中癌基因表达产物的水平以研究肿瘤调控因素 凋亡受内外环境中各种因素构成的网络控制和基因控制 利用各种调控因素的作用 有目的地诱导或控制细胞凋亡 可能是增加化疗效果 消灭肿瘤细胞的新途径 FCM通过对凋亡的检测 可以研究调控因素如癌基因 r 射线 温度及化疗药物等对凋亡的影响 最终达到治病的目的 流式细胞仪在血液学中的应用 一 白血病和淋巴瘤FCM可选择已标记的CD系列及其他单克隆抗体对白血病进行免疫表型分析 免疫表型分析 提高亚型诊断水平 白血病细胞免疫分型的特点 反映了其本质上与相应正常骨髓细胞的差异 白血病细胞丧失了正常细胞的系列专一性和分化阶段规律性 此特点有利于鉴别诊