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RNA提取方法及原理 第八组 一 研究背景二 方法及原理 1 研究背景 1 1RNA研究的重要性DNA RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子 是生命现象的分子基础 DNA的遗传信息决定生命的主要性状 而mRNA在信息传递中起很重要的作用 其它两大类RNA rRNA和tRNA 同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能 因此mRNA rRNA tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重 1 2RNA分布 2 方法及原理 2 1RNA的提取流程1 样本前处理2 细胞裂解3 RNA的纯化及获得 RNA提取流程 样品前处理注意点 选择新鲜血液 不得超过4小时 选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞 选择新鲜组织 生长旺盛的组织 可将新鲜血液先进行红细胞裂解 得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol 70 保存较长时间 去掉培养基 加入一定量TRNzol 70 保存较长时间 推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存 液氮或加入RNase抑制剂中保存 避免反复冻融 RNA提取流程 样品前处理中如何保存样本 RNA提取流程 细胞裂解 以释放RNA 异硫氰酸胍 酚 TRNzol总RNA提取试剂 独特配方 RNAplant植物RNA提取试剂 胍盐 巯基乙醇 RNAprep系列RNA提取试剂盒 RNA提取流程 RNA的纯化及获得 RNA纯化要求 1纯化后不应存在对酶 如逆转录酶 有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质 多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染 2 2RNA提取的注意事项2 2 1杜绝外源酶的污染一 严格戴好口罩 手套 二 实验所涉及的离心管 Tip头 移液器杆 电泳槽 实验台面等要彻底处理 三 实验所涉及的试剂 溶液 尤其是水 必须确保RNase Free 2 2 2阻止内源酶的活性一 选择合适的匀浆方法 二 选择合适的裂解液 三 控制好样品的起始量 2 2 3明确自己的抽提目的一 任何裂解液系统在接近样品最大起始量时 抽提成功率急剧下降 二 RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功 而不是得率 2 3Rnase污染的10大来源1 手指头2 枪头3 水 缓冲液4 实验台面5 内源Rnase6 RNA样品7 质粒抽提8 RNA保存9 阳离子 Ca Mg 10 后续实验所用的酶 2 4几种RNA提取方法2 4 1TRIzol法TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂 它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性 加入氯仿后离心 样品分成水样层和有机层 RNA存在于水样层中 收集上面的的水样层后 RNA可以通过异丙醇沉淀来还原 在除去水样层后 样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原 乙醇沉淀能析出中间层的DNA 在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白 共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用 TRIzol法提取流程1 样品处理 培养细胞 收获细胞1 5 107 移入1 5ml离心管中 加入1mlTrizol 混匀 室温静置5min 组织 取50 100mg组织 新鲜或 70 及液氮中保存的组织均可 置1 5ml离心管中 加入1mlTrizol充分匀浆 室温静置 min 2 加入0 2ml氯仿 振荡15s 静置2min 3 4 离心 12000g 15min 取上清 4 加入0 5ml异丙醇 将管中液体轻轻混匀 室温静置10min 5 4 离心 12000g 10min 弃上清 6 加入1ml75 乙醇 轻轻洗涤沉淀 4 7500g 5min 弃上清 7 晾干 加入适量的DEPCH2O溶解 65 促溶10 15min 细胞 实验流程图 细胞选择 贴壁细胞悬浮细胞 2 4 2苯酚法细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起 以核蛋白的形式存在 因此 提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去 将细胞置于含有十二烷基磺酸钠 Sodiumdodecylsulfate SDS 的缓冲液中 加等体积水饱和酚 通过剧裂振荡 然后离心形成上层水相和下层酚相 核酸溶于水相 被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相 或者在两相界面处形成凝胶层 苯酚法提取酵母RNA取1g活性干酵母在研钵中研碎 加10mLSDS 缓冲液使成匀浆 洗入各Eppendorf管 略少于管容积的一半 加溶菌酶0 1mL 混匀 室温静置10min 再加等体积饱和酚液 室温下剧烈振荡5min 置冰浴中分层 在0 4 低温环境下 10000r min离心10min 吸出上层清液 转入新的Eppendorf管 加等体积氯仿 异戊醇 室温下剧烈振荡2 5min 然后10000r min离心5min 吸出上层清液 转入另一新Eppendorf管 加2倍体积95 乙醇 含2 乙酸钾 在冰浴中放置30min 使RNA沉淀 再以10000r min离心5min 弃上清液 沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次 即加乙醇或乙醚 迅速离心各1min 保留沉淀 倾去乙醚后 减压真空干燥 准确称重 记录 2 4 3异硫氰酸胍 酚法异硫氰酸胍 酚法提取RNA的原理如下 GIT与 巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性 GIT与十二烷基肌氨酸钠 Sarcosyl 作用使蛋白质变性 从而释放RNA 酸性条件下DNA极少发生解离 同蛋白质一起变性被离心下来 RNA则溶于上清中 该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA 逆转录及构建cDNA文库 异硫氰酸胍 酚法提取植物组织总RNA1 取2g左右植物组织放入研钵中 反复加入液氮充分研磨至粉末状 加4 5mL异硫氰酸胍溶液 转移到小离心管中 每管0 5mL 2 置于冰上 顺序加入 50 l2mol LNaAc 混匀 0 5mL水饱和酚 170 lCI 混匀 置冰上15min 3 各管平衡后 4 12000g离心20 30min 转移上清到另一管中 加入等体积的异丙醇 混匀 20 沉淀30min 1hr或 80 沉淀10min 4 12000g离心20min回收RNA 4 用70 乙醇洗一次 4 12000g离心5min 吸去乙醇 空气中吹干RNA沉淀 用150 l异硫氰酸胍溶液 65 吹打RNA沉淀溶解 5 加等体积异丙醇 20 沉淀30min 1hr或 80