DB32∕T 3628-2019 木霉固态菌种生产技术规程

ICS 65.080 B 13 备案号： DB32 江苏省地方标准DB32/T 36282019 木霉固态菌种生产技术规程 Technical regulation for production of solid Trichoderma spp. spawn 2019 -07 -11 发布 2019 -08 -01 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 36282019 前言本标准按GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由南京农业大学提出并归口。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准主要起草人：沈其荣、刘东阳、黄启为、李荣、凌宁。 IDB32/T 36282019 木霉固态菌种生产技术规程 1 范围 本标准规定了木霉固态菌种生产中所涉及的生产场地要求、生产流程、产品检测、建立生产档案、 包装及贮存运输要求等技术环节。 本标准适用于木霉固态菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 是注日期的引用文件， 凡仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 191 包装储运图示标志 GB 3095 环境空气质量标准 GB 3838 地表水环境质量标准 GB 20287 农用微生物菌剂 NY/T 883 农用微生物菌剂生产技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 固态菌种 solid spawn 生长在固态培养基料上的菌种。 3.2 微生物接种剂 microbial inoculant 一种或一种以上的目的微生物经工业化生产增殖后直接使用， 或经浓缩或经载体吸附而成的活菌制 品。 3.3 固体培养基 solid medium 以富含木质纤维素或淀粉类天然物质为主要原料，添加适量的有机氮源及无机盐类，具一定水分含 量的培养基。 4 生产场地要求 1DB32/T 36282019 4.1 生产基地选择 生产基地应远离居住区、城区等，并且交通便利，生态环境优良，周边植被覆盖率高。生产地块集 中连片并位于原料收集区较近的地方。车间保温保湿性能良好，同时具备通风性能。 4.2 生产环境 厂区空气质量达到大气环境质量标准GB 3095中II类标准要求。 发酵用水达到地表水质量标准GB 3838中III类水质要求，冷却水及其他用水应达到标准IV类水质要 求。 4.3 生产车间 4.3.1 原料库 原料库要求水电方便，平坦干燥、通风良好，光照充足、空旷宽阔，远离火源，注意防火设施的建 设。 4.3.2 接种室 接种室必须设缓冲间，通风和保温性能良好，并具有防尘换气性能，墙内壁和屋顶光滑，必须做好 杀菌消毒工作，确保接种室环境的相对无菌。 4.3.3 培养室 培养室内壁和屋顶光滑，便于清洗与消毒，有条件的单位可以建设半地下室的培养室，或者将培养 室墙壁加厚，有利于培养室的控温。 4.3.4 检验室 检验室宜留出便于检验仪器设备安装的场所，同时水电布局要求合理，建立车间环境卫生制度，定 期对生产设备和环境消毒的。 5 生产流程 5.1 技术环节 木霉固态菌种主要包括木霉高密度液体发酵、 固体基质准备、接种木霉液体菌种、固体发酵的控制、 固态菌种后处理、产品包装、质量检测及出厂等技术环节。具体工艺流程见附录A。 5.2 菌种要求 5.2.1 原种 原种是生产用菌种的母种，对原种有如下要求： 原种应有菌种鉴定报告。 原种应有菌种的企业编号、来源信息等。 5.2.2 菌种保管 采用固体曲保藏和冻干管保藏的方法保藏木霉固体孢子，确保无杂菌污染，菌种不退化。分类纯化 并定期检查，建立菌种档案。 2DB32/T 36282019 5.2.3 菌种质量控制 在进行生产之前，应对所使用的菌种进行检查，并确认其纯度和性能没有发生退化，如出现污染或 者退化情况，该菌种不能作为生产用菌种，应该按照标准NY/T 883执行。 5.3 液体发酵增殖 木霉菌种的液体发酵增殖，按照NY/T 883执行。具体的培养基见附录B。 木霉菌丝体采用棉兰染色法观察：在载玻片中央滴加一滴无菌水，并将菌丝体均匀分布其中，盖上 盖玻片，尽量不留气泡，从一侧滴加少量的棉兰染色液染色5 min，染色结束后用无菌水慢慢冲洗染色 液，表面风干后在显微镜下观察，染色液配方具体见附录C。菌丝清晰可见，生长良好，没有出现杂菌 污染，可以作为菌种继续使用；如果菌丝细小并呈不规则分布或者有杂菌污染，应按标准NY/T 883处 理。 5.4 固体培养基制备 5.4.1 培养基要求 发酵培养基要求接种后木霉菌丝体生长旺盛，在保证有一定的生物量（菌丝体）的前提下兼顾分生 孢子及有效代谢产物的产生。 原料要求来源充足、价格合理、营养成分充足，宜采用农作物秸秆及农用氨基酸作为主要原料。 5.4.2 制备过程 5.4.2.1 秸秆前处理 以农作物秸秆作为发酵基质，使用前晾干（含水率约15%，含有机质约65%）并用粉碎机将其粉碎 成0.3 cm0.4 cm长的片段。 5.4.2.2 氨基酸添加 往上述秸秆中添加氨基酸稀释液， 氨基酸稀释液的添加量为每100 g晒干后的秸秆加入100200 mL 的氨基酸稀释液（氨基酸原液总氨基酸含量10%），调节起始pH为3.04.0，物料的含水率应该严格 控制在50%60%之间，陈化4 h6 h后备用。 5.4.3 灭菌 5.4.3.1 高压蒸汽灭菌要求 固体发酵培养基物料灭菌温度为121130，灭菌时间为1.0 h2.0 h；或者采用100灭菌2 h 4 h，24 h后再灭菌一次。 5.4.3.2 灭菌效果检测 将1 g固体发酵产物加入到9 mL无菌水中，充分混匀后制成悬液，吸取1 mL悬液加入到装有已灭菌 的9 mL营养肉汤的试管中，并做至少三个生物学重复，将试管置于37恒温培养箱中避光培养，24 h 内无浑浊、镜检无菌体后即可判定彻底灭菌，反之则判定为灭菌不彻底，不可用于固体发酵。 5.5 接种 3DB32/T 36282019 固体发酵培养基高温蒸汽灭菌后，待其降至室温，尽快将灭好菌的固体发酵培养基转移至固体发酵 培养室。将发酵好的木霉菌丝体按5%的接种量（v/w，鲜重）接种到固体发酵培养基料中并充分拌匀， 分装到不同的浅盘当中，并将塑料浅盘转移到具有控温控湿功能的发酵室内进行培养。 5.6 发酵控制 5.6.1 培养温度 固体发酵的温度应该严格控制在（282），根据不同木霉发酵特性和生长代谢特征，适当调整 到最佳的发酵温度。 5.6.2 物料含水率 固体发酵初期，最适宜的物料含水率应该控制在50%60%之间，发酵结束后，发酵产品的含水率 应该控制在20%40%之间。 5.6.3 空气湿度 固体发酵过程中，空气湿度宜严格控制在70%75%之间。 5.7 发酵终点判断 5.7.1 物理性状 采用感观法评价固体发酵物料的颜色、形态和气味。 5.7.2 孢子定量 5.7.2.1 稀释涂布 以无菌操作取样25 g转至225 mL无菌生理盐水中，并充分震荡后制成1：10的菌悬液。并利用梯度 稀释法进行样品稀释，吸取最后的稀释液0.1 mL于木霉选择性培养基上（见附录B），并用涂布棒将菌 悬液涂布均匀。 5.7.2.2 培养 在28恒温培养箱中避光培养2 d3 d，注意观察菌落的生长情况。 5.7.2.3 计数 记录各平板的菌落总数，求出不同稀释度平板中的平均菌落数，计算出每克原始样品中的菌落 数。 固体发酵产物中有效活菌数含量4.0109个/克。 6 产品检测 6.1 有效活菌数检测 按照5.7.2的方法检测发酵产物中的有效活菌数。 6.2 杂菌率检测 杂菌率的检测按照GB 20287执行，木霉固体发酵产物的杂菌数应1.0104个/克。 4DB32/T 36282019 6.3 其他项目检测 固体发酵物的细度、有害元素含量（Hg、Pb、Cd、Cr、As）、pH（5.57.5）、大肠杆菌数、蛔 虫卵死亡率值达到NY/T 883的要求。 7 建立生产档案 每批次生产的产品，必须建立完善的生产档案，包括产品检验项目、检验结果、实验人、批准人以 及检验日期等准确信息。 8 包装及贮存运输要求 8.1 包装 包装标签按 GB/T 191规定执行。 8.2 贮存 产品应贮存于阴凉干燥处，环境温度不宜超过30，并避免与化肥、农药等一同贮存。 8.3 运输 在运输过程中应注意防潮、防晒、防破裂。 5DB32/T 36282019 附录A （规范性附录） 木霉固态菌种生产技术规程示意图 发酵原种 原种复壮 退化 菌种纯度检测及其功能分析 污染 原种纯化 发酵过程的 优化与控制 液体菌种 的检测 按规定处理 检测不合格 检测合格 固体发酵过程 中发酵参数的 优化与控制主 要包括 pH、 含水率、发酵 时间等 检测不合格 按规定处理 固体菌种包装 质量检验 检测合格 出厂 6DB32/T 36282019 附录B （规范性附录） 培养基及其配方 原种培养基及其配方：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基），其中马铃薯200 g煮沸后取滤液， 葡萄糖20 g，琼脂25 g，水1000 mL，pH调整为5.0。 摇瓶种子培养基及其配方：马铃薯葡萄糖液体培养基， 其中马铃薯200 g煮沸后取滤液， 葡萄糖20 g， 水1000 mL，pH调整为5.0。 液体发酵培养基及其配方： 土豆150 kg/T、 糖15 kg/T、 蔗玉米粉5 g/T、NH4)2SO4 5 kg/T、 SO4H2O (Mg 70.5 kg/T、KH2PO4 1kg/T、pH自然；pH调整为5.0。 固体发酵培养基：农作物秸秆（优选水稻秸秆和玉米秸秆，含水率约15%，含有机质量约65%）晾 干后用粉碎机将其粉碎成0.3 cm0.4 cm长的片段；往上述秸秆中添加氨基酸稀释液，氨基酸稀释液的 添加量为每100 g晒干后的秸秆加入100 mL200 mL的氨基酸稀释液（相当于100 g晒干后的秸秆中加入 10 mL20 mL的氨基酸水解液原液，氨基酸原液中总氨基酸的含量10%），调节起始pH为3.04.0， 初始含水率严格控制在50%60%之间，陈化4 h6 h后备用（可以对秸秆进行预处理，更利于木霉利 用秸秆）。 木霉选择性培养基：蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，琼脂20.0 g/L，孟加拉红0.033