毒理学第七章 化学物致突变作用

第7章外源化学物致突变作用 主讲教师 陈华email gwyb2 本章节主要内容 化学物致突变作用相关概念致突变的类型致突变作用的机制及后果机体对致突变作用的影响观察致突变作用的基本方法 1遗传 genetics 生物物种以相对稳定的生命形式和性状存在于自然界 通过各种繁殖方式来保证世代间生命延续的过程 第一节相关概念 2变异 variation 同一物种在亲子之间或子代个体之间出现的种种差异 产生变异的原因有 1 亲代个体杂交产生子体 由于重组而发生 2 由于基因突变而发生 它是新基因产生的根本来源 3 由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生 3突变 mutation 遗传结构本身的变化及引起的变异 即可遗传的变异 自发突变 spontaneousmutation 在自然遗传过程中发生的突变 概率极低 与物种进化有密切关系 诱发突变 inducedmutation 人为或受外来因素诱发的突变 视为一种对机体的损害作用 5遗传毒性 genetictoxicity 指对基因组的损害能力 包括对基因组的毒作用引起的致突变性及其他各种不同效应 致突变性指引起遗传物质发生突变的能力 6遗传毒理学 genetictoxicology 研究外源化学物和其它环境因素对生物体遗传结构的损害作用及其作用规律 应用检测系统发现和探究致突变物 提出评价致突变物健康危害的方法 7DNADNA是大分子物质 由脱氧核糖 磷酸及碱基组成 其基本成分为四种核苷酸 形成双螺旋结构 8基因 gene 基因是DNA分子中最小的完整功能单位 基因的基本作用在于决定蛋白质的一级结构 即每个基因决定一条多肽链或者说一个基因决定一种酶 基因是生物遗传信息的携带者 细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质称基因组 genome UAAUGAUAG 第二节化学毒物致突变的类型 根据DNA改变牵涉范围的大小 致突变作用主要引起两类遗传学损伤 基因突变和染色体损伤 染色体畸变 染色体数目改变 基因突变 染色体畸变及染色体数目变化的本质是相同的 其区别在于受损程度 通常以光学显微镜的分辨率0 2um来区分基因突变和染色体损伤 FormationofMutation GeneMutations ChromosomalMutations 1 表型改变检测2 DNA序列改变检测 一 基因突变基因突变 genemutations 指基因中DNA序列的变化 即遗传物质在分子水平上的改变 因基因突变限制于DNA分子序列的某一特定部位 故称为点突变 pointmutation 基因突变的类型有两类 分别是碱基置换和移码突变 1 碱基置换碱基置换 basesubstitution 指以另一种碱基替代了原来的碱基 是因某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变 碱基置换又分为转换 transition 和颠换 transversion DNA的一对碱基 如G C 被另一对碱基 如A T 所取代 如果是嘌呤置换另一嘌呤 或者是嘧啶换另一嘧啶称转换 如果是嘧啶换成嘌呤 或者嘌呤换成嘧啶称颠换 G C A Ttransition G C T Atransversion 终止密码 错义密码 nonsensemutation missensemutation 碱基置换图 transition transversion 2 移码突变移码突变 frame shiftmutation 指发生一对或几对 3对除外 的碱基减少或增加 以致从受损点开始碱基序列完全改变 形成错误的密码 并转译成为不正常的氨基酸 错义密码 终止密码 终止密码 错义密码 nonsensemutation missensemutation 移码突变图 1移动码突变 2移码突变 二 染色体畸变染色体畸变 chromosomeaberration 指染色体的结构改变 它是指遗传物质大的改变 一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现 染色体结构异常的原因是由于染色体或染色体单体受损而发生断裂 且断端不发生重接或虽重接却不在原处 可分为染色单体型畸变 chromatid typeaberration 染色体型畸变 chromosome typeaberration ChromosomalMutations 常见染色体结构异常的类型 1 缺失 deletion 染色体上丢失了一个片段 2 重复 duplication 在一套染色体里 一个染色体片段出现不止一次 3 倒位 inversion 一个染色体片段被颠倒了 颠倒的片段包括着丝点 称为臂间倒位 pericentricinversion 不包括着丝点则称为臂内倒位 paracentricinversion 4 易位 translocation 一个染色体片段的位置发生改变 最常见的是相互易位 reciprocal 涉及两个非同源染色体片段的交换 稳定的染色体畸变 如缺失 倒位 重复及平衡易位等 多数为染色体重排 可在机体或细胞群传递 形成突变细胞 不稳定的畸变 如无中心粒的片段 双中心粒染色体 环状染色体及各种其它不对称重排等 通常由于他们丧失了重要的遗传物质或有丝分裂的机械障碍导致细胞死亡 三 染色体数目改变指染色体数量的增加或减少 分为非整倍体和多倍体 表1不同物种动物的染色体数目 非整倍体 aneuploidy 指增加或减少一条或几条染色体 例如 Down氏综合征 由21染色体三体 trisome21 所致 它多了一条染色体 有三条21染色体 染色体数目为47条 即该病由非整倍体所引起 三体 2n 1 47trisome21 Downsyndrometrisome21 多倍体 polyploidy 指染色体数目成倍增加 如人类体细胞正常为二倍体 2n 有46条染色体 如果有69条染色体 则定义为多倍体 此为三倍体 四倍体 tetroploid 4n 96 第三节化学毒物致突变作用的机理及后果 一 引起突变的DNA变化 一 碱基损伤1 碱基错配2 平面大分子嵌入DNA链3 碱基类似物取代4 碱基的化学结构改变或破坏 一 引起突变的DNA变化 二 DNA链受损1 二聚体的形成2 DNA加合物形成3 DNA 蛋白质交联物 DNA proteincrosslinks DPC 形成 TypesofDNAdamage Gene 250 15 30 2000 二 引起突变的细胞分裂过程的改变 1 与微管蛋白二聚体结合2 与微管上的巯基结合3 已组装好的微管的破坏4 中心粒移动受阻5 其它作用 三 其它的改变 1 影响复制有关的酶类及组蛋白和非组蛋白2 影响DNA修复 四 突变的后果 突变的后果 取决于化学毒物所作用的靶细胞是生殖细胞 还是体细胞 如是体细胞 其影响仅能在直接接触该物质的个体身上表现来 而不可能遗传到下一代 如是生殖细胞 其影响才有可能遗传到下一代 四 突变的后果 一 生殖细胞突变1 引起许多按孟德尔定律遗传的疾病 在新生儿遗传病中 约有1 3 为常染色体显性遗传病 0 25 为常染色体隐性遗传病及0 05 与性染色体遗传有关 实例 链形细胞贫血 正常人血红蛋白 HbA 链N端第六位上的氨基酸为谷氨酸 链形细胞贫血患者血红蛋白 HbS 此位的氨基酸变为缬氨酸 原因是其密码子由GAA突变为GUA 实例 白化病 是由于基因突变 导致体内的黑色素或黑色素体生物合成缺陷 从而表现为皮肤 眼睛 毛发色素缺乏的一种遗传病 四 突变的后果 一 生殖细胞突变2 引起人类许多复杂病因的疾病 遗传因素起着部分作用 即增加下一代基因库 genepool 的遗传负荷 geneticload 四 突变的后果 一 生殖细胞突变基因库指某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和 遗传负荷指一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平 四 突变的后果 一 生殖细胞突变3 造成生殖障碍胚胎死亡 畸胎 胚胎功能不全 生长迟缓 四 突变的后果 一 生殖细胞突变又分为显性突变 遗传性疾病 生殖障碍 死亡显性致死突变使精子不能受精 或合子在着床前死亡或着床后早期胚胎死亡 四 突变的后果 一 生殖细胞突变隐性突变 遗传性疾病或携带 生殖障碍 死亡 隐性致死突变需纯合子或半合子才能出现遗传疾病或死亡 四 突变的后果 一 生殖细胞突变非致死性突变 显性遗传将造成下一代遗传病发生率增加或新病种出现 隐性遗传则增加下一代基因库的遗传负荷 致死性与非致死性突变所致后果 对人类健康的意义是不同的 致死性突变将导致死胎 它影响后代的数量而非质量 非致死性突变主要影响后代的质量 四 突变的后果 二 体细胞突变体细胞突变后果 肿瘤 衰老 动脉粥样硬化 致畸突变在肿瘤发生过程中中心作用的重要证据是来自于癌基因和抑癌基因突变的分子生物学研究 肿瘤发生涉及癌基因的活化和抑癌基因的失活 肿瘤从本质上讲是基因病 原癌基因 癌基因 肿瘤抑制基因 凋亡调节基因以及DNA修复基因 如果发生异常改变 则可引起肿瘤的发生 第四节机体对致突变作用的影响 机体保证遗传稳定性的机制 1 DNA执行高保真度的复制 对复制中的错误能及时纠正 即通过修复而达到高度保真 2 机体已进化有多种机制修复DNA损伤 以保护亲代DNA链 使其免受化学毒物的作用而发生改变 机体修复DNA损伤的机理可分为两大类 损伤耐受机理和修复机理 损伤耐受指DNA遗传可绕过那些阻止DNA复制的DNA损伤 DNA修复分为直接修复和切除修复 直接修复指引起DNA损伤的反应为可逆性的 如光修复 切除修复指将损伤或不正确的碱基去除和替换 如核苷酸去除 它是负责较大范围损伤的修复 一 DNA损伤的修复 1 直接修复直接修复存在多数生物体内 主要依赖酶作用 如光裂合酶和烷基转移酶 光复活主要是针对紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体的修复机理 适应性 反应烷基转移酶将鸟嘌呤O6位甲基转给O6 甲基鸟嘌呤 DNA甲基化转移酶 这样 鸟嘌呤可恢复其正常的碱基配对特性 1 光复活 photoreactivation TT AA 复制前修复 不容易出错 400nm蓝光 PR酶 photo reactivationenzyme 光敏裂合酶 photolyase 二聚体光修复的机制 一 DNA损伤的修复 2 切除修复切除修复是负责较大范围损伤的修复机理 它是一多步骤修复过程 分为两种 一是切除核苷酸修复 另一是切除碱基修复 核苷酸切除修复核苷酸切除是所有生物体内最常见的修复机理 它基本上可修复所有种类的DNA损伤 包括紫外线光产物 较大的DNA加合物 DNA链间交联等 碱基切除修复碱基切除修复的DNA糖基酶专一性强 每一种都特异地识别一种或少数几种异常碱基 2 切除修复Exision Repair 复制前进行不易出错 内切核酸酶 Endonucleases 外切核酸酶 Exonuclease DNApolLigase 碱基切除修复 核苷酸切除修复 碱基切除修复 核苷酸切除修复 螺旋酶 Pol 螺旋酶 连接酶 切 补 切 封 一 DNA损伤的修复 3 错配修复可以识别并除去错配的碱基对 如G T和A C 象这样的碱基对可作为重组中间体 在复制时错误地出现或者通过碱基活性修饰如5 甲基胞嘧啶的脱氨作用而发生 3 DNA错配修复的模型 4 双链断裂修复严格来说 双链断裂修复不是修复 而是一种耐受过程 一种以容忍损伤继续存在和在高突变率情况下 以换取细胞继续生存的耐受过程 为了尽可能的减少DNA双链断裂 细胞有一套特定的修复途径 通过同源重组或者非同源性末端连接机制被修复 重组修复 链转移修复 复制后修复容易出错 RecA DNApolymeraeligase 二聚体后起始 RecA 聚合酶 连接酶 重组修复后的损伤位点可由其它机制进一步修复 一 DNA损伤的修复 5 交联修复当细胞内发生DNA链内交联 会造成双链的断裂 机体启动两种修复 1 无误交联修复 降解双螺旋 使链内交联转变为链内二核苷酸加合物接连于双链断裂处 随后Hollidy连接体分解 核苷酸切除修复最终去除二核苷酸交联 2 易误交联修复 其作用是次要的 包括整个核苷酸切除修复和易误DNA聚合酶 致突变损伤模式 化学致突变作用损伤的模式损伤 修复 突变 二 遗传因素对致突变作用的影响 个体因素影响致突变作用有两个方面一是先天性 即遗传因素 也就是遗传多态性 geneticpolymorphysm 二是后天性 主要指不同生活方式如吸烟 饮酒 营养缺乏或不平衡 年龄等 一般认为 遗传多态性在个体因素影响致突变作用中起决定作用 再者 后天性的敏感亦有可能在一定遗传背景上出现 二 遗传因素对致突变作用的影响 一 代谢酶遗传多态性遗传多态性是一个衡量遗传变异的数据 即群体中多态基因的比例 多态性的标准是 当一个基因座位的最常见的等位基因频率不超过0 95时 这个基因座位即是多态性 1 氧化代谢酶2 酯酶3 谷胱甘肽硫转移酶 GST 二 遗传因素对致突变作用的影响 二 修复功能的个体差异1 O6 甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶 MGMT 是体内一种特异性修复酶 2 聚 二磷酸腺苷 核糖 多聚酶 PARP PARP的激活为DNA损伤后细胞的早期反应之一 它催化的反应作为DNA损伤的一系列细胞反应的过程之一 可影响DNA修复及损伤的结局 第五节观察化学毒物致突变作用的基本方法 一 观察项目的选择1 观察效应终点的类型将致突变试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点 geneticendpoint 1 观察的效应终点类型 国际环境致突变物致癌物防护委员会 ICPEMC 于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类 DNA完整性的改变 形成加合物 断裂 交联 DNA重排或交换 DNA碱基序列改变 染色体完整性改变 染色体分离改变 其中 实际上指基因突变 指染色体畸变 一 观察项目的选择 2 成套的观察项目遗传毒理学试验中 包括基因突变 断裂作用 重组作用 非整倍体或多倍体的测定试验 受试化合物在任何一种试验中出现可重复的阳性结果 即可认为是遗传毒物 成套观察项目入选的原则 一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点 配套实验应包括多种进化程度不同的物种 如原核细胞 低等和高等真核细胞 体内试验与体外试验配合 应包括生殖细胞和体细胞 二 常用的致突变试验 一 细菌回复突变试验 Ames试验 细菌回复突变试验是利用突变体的测试菌株 观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变 判断其致突变性 常用的菌株1 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonellatyphimurium 2 大肠杆菌 E Coli 一 细菌回复突变试验 Ames试验 试验原理选用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型细菌 该菌在组氨酸缺乏的培养基上不能生长 若在含被检物的培养基上生长 证明被检物使该菌发生了回复突变 可以自身合成组氨酸 计数菌落数可判断受试物的致突变性 阳性含高浓度诱变剂 阳性含适当浓度诱变剂 二 常用的致突变试验 二 微核试验微核 micronucleus 与染色体损伤有关 是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体 在细胞分裂后期遗留在细胞质中 末期之后 单独形成一个或几个规则的次核 包含在子细胞的胞质内 因比主核小 故称微核 微核试验 micronucleustest MNT 是观察受试物能否产生微核的试验 其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂 二 常用的致突变试验 三 染色体畸变分析观察染色体形态结构和数目改变称为染色体畸变分析 chromosomeaberrationanalysis 又称细胞遗传学试验 cytogeneticassay 二 常用的致突变试验 四 姐妹染色单体交换试验SCE是化学毒物引起的一种细胞遗传损伤 主要反映受试物导致染色体同源点上DNA复制产物互换频率的改变 SCE频率可反映细胞在S期DNA受损程度 二 常用的致突变试验 五 果蝇伴性隐性致死试验是利用隐性基因在伴性遗传中具有交叉遗传特征 选择黑腹果蝇为实验动物 给予雄蝇受试物 如雄蝇的X染色体有突变 传给F1代雌蝇 再通过F1代雌蝇传给F2代雄蝇 使位于X染色体上的隐性基因在半合型雄蝇表现出来 二 常用的致突变试验 六 显性致死试验显性致死试验 dominantlethaltest 是一种体内试验 用于检测整体哺乳动物生殖细胞遗传性损伤 显性致死突变指哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目变化 出现的受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡 它是评价化学毒物对雄性动物的生殖细胞遗传毒性较好的方法之一 还可进一步确证体外试验或其他试验系统获得的阳性结果 二 常用的致突变试验 七 程序外DNA合成试验当DNA损伤时 即会发生在S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成 称之为程序外DNA合成 它是机体为保证其遗传特征的高度稳定而对DNA双链上出现的变异或损伤进行修复合成的过程 二 常用的致突变试验 八 单细胞凝胶电泳试验原理是在DNA损伤时 断裂的DNA片段比大片段DNA迁移更快 电泳后出现彗星状 即可判断DNA损伤 观察方法的新进展 1 转基因小鼠致突变检测系统2 微核自动化检测技术3 荧光原位杂交技术 三 致突变试验中的一些问题 一 阴性 阳性对照的设立1 阴性对照它是空白对照 即不加任何处理 或者是溶剂对照 目的是获得实验的基础数据 2 阳性对照是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照 其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠 验证实验者在本实验条件下 完成技术和鉴定致突变物的能力 证实经一段时间后 本实验的重复性 三 致突变试验中的一些问题 二 体外试验的活化系统由于微生物和培养的哺乳动物细胞缺乏整体动物体内的许多代谢能力 在遗传毒理学试验中 必须加入代谢活化系统以检出前致突变物 二 体外试验的活化系统 1 哺乳动物细胞介导使用完整的细胞 特别是大鼠肝原代细胞 与测试细菌或细胞一起培养 2 S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆 再经9000g离心分离所得上清液 加上适当的缓冲液和辅助因子 3 纯化酶和基因工程纯化细胞色素P450 谷胱甘肽转移酶及过氧化物水解酶 可严格控制代谢产物诱发突变的条件 但技术难度大 三 致突变试验中的一些问题 三 致突变试验与致癌试验的关系化学物质按遗传毒性和致癌性可分为 遗传毒性致癌物 非遗传毒性致癌物 遗传毒性非致癌物和非遗传毒性非致癌物四类 致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物 有可能出现假阳性如遗传毒性非致癌物和假阴性如非遗传毒性致癌物 三 致突变试验中的一些问题 四 试验结果在毒理学安全性评价中的作用在评定阳性或阴性之前 应首先检查实验的质量控制情况 致突变试验的质量控制通过以下措施来实现 设立阴性对照和阳性对照 其意义前已述及 盲法观察 指观察人员不了解观察标本的染毒剂量或组别 以免除观察人员对实验数据产生主观影响 资料的统计学分析 它是检验各处理组与对照组之间的差异 研究剂量 反应关系和定量强度 试验结果的重现性 即重复试验所得到的相同结果 重复试验指在不同时间完成的试验 而并非试验中的平行样本 四 试验结果在毒理学安全性评价中的作用 阴性结果判定条件 最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量 如该剂量毒性很大 则体内试验和细菌试验应为最大耐受量 使用哺乳动物细胞进行体外试验 常选LD50或LD80为最大剂量 溶解度大 毒性低的化学物 在细菌试验中可以5000ug 皿作为最高剂量 各剂量组的组间差距不应过大 以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物 满足上述条件 仍为阴性 才慎重下结论 四 试验结果在毒理学安全性评价中的作用 阳性结果判定条件 阳性结果应具有剂量反应关系 即随剂量增加 致突变作用增加 和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异 阳性结论 即表明受试物具有致突变性 而不同致突变试验的遗传学终点不同 其所表示的含义不一 如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变 DNA修复的实际后果尚不明确 参考书目1基础毒理学江泉观主编北京 化学工业出版社 1991 42中国医学百科全书 毒理学顾学箕主编上海 上海科学技术出版社 19823毒理学 英 卡萨瑞特 道尔 CurtisD Klassen 著北京 人民卫生出版社 20024毒理学辞典吴中亮等主编武汉 湖北科学技术出版社 20055毒理学教程周宗灿编著北京 北京大学医学出版社 2006 Summary小结Categoriesofchemicalmutationaregenemutationsandchromosomesmutations 化学物致突变作用分为基因突变 genemutation 和染色体突变 chromosomesmutation Genemutationsinvolveadditionordeletionofbasepairsorsubsti