天津大学生物化学课件ppt 第五章45节修改

第四节核酸的提取 分离和测定 一 RNA的分离提取 二 DNA的提取和分离 三 核酸含量的测定 一 RNA的分离提取1 目前最常用的为酚提取法 即用缓冲液饱和的酚溶液直接处理组织或细胞 以除去其中的蛋白质和DNA若加入适量十二烷基硫酸钠或其它去污剂可进一步抑制核糖核酸酶 并使蛋白质去除得更加干净 将得到的RNA提取液用乙醇反复沉淀数次 溶解后进行透析 再冷冻干燥 提取不同种类的RNA时 也可将各种亚细胞部分事先分开 因为不同种类的RNA存在于细胞中的不同部位 然后分别从核蛋白体中提取rRNA 从多核蛋白体中提取mRNA 从去除这些成分及其它颗粒后的细胞液中提取tRNA 一 RNA的分离提取2 1 密度梯度离心法2 2 柱层析法 3 凝胶电泳法 一 RNA的分离提取3 1 离心管中放30 5 的蔗糖溶液 欲分离RNA溶液放在蔗糖溶液面上 经高速离心数小时后 分子大小不同的RNA即分散于不同密度的蔗糖部位中 应用啡啶溴红 氯化铯密度梯度平衡超离心 可分开不同构象的DNA RNA和蛋白质 1 密度梯度离心法1 一 RNA的分离提取3 2 1 密度梯度离心法2 用垂直转头65000转6h 角转头45000转36h 离心后 蛋白质在最上面 RNA沉淀在底部 超螺旋DNA沉淀较快 开链或环形DNA沉淀较慢 此法分离的DNA纯度较高 可供DNA重组等实验用 如需更纯品 可再进行一次氯化铯密度梯度离心 一 RNA的分离提取4 2 柱层析法 常用的支持体为二乙胺乙基 DEAE 纤维素 离子交换 葡聚糖凝胶等 凝胶过滤 因为核酸和核苷酸是两性电解质 在一定的pH值条件下各解离基团的解离情况不同 即有与蛋白质相似的等电点 南大P147 一 RNA的分离提取5 3 凝胶电泳法 不同种类的RNA分子所带电荷与其质量之比都非常接近 故用一般电泳方法不易分开 若以某些凝胶为支持体进行电泳 由于凝胶的分子筛作用可影响不同RNA的泳动速度 则可得到较好的分离效果 二 DNA的提取和分离 0 14mol法 三 核酸含量的测定1 紫外吸收 嘌呤碱与嘧啶碱有共轭双键 使碱基核苷 核苷酸和核酸在240 290nm紫外波段有一强烈的吸收峰 最大吸收值在260nm附近 不同核苷酸有不同的吸收特性 所以可以用紫外分光光度计定量及定性测定 三 核酸含量的测定2 对待测样品是否纯品可用260nm与280nm的OD值 从OD260 280的比值即可判断 纯的DNA的比值应为1 8 纯RNA为2 0 如样品中含杂蛋白 测量比值明显下降 通常1OD值相当于50 g ml双螺旋DNA或40 g ml单螺旋DNA 或RNA 或20 g ml寡核苷酸计算 不纯的样品可用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后 经啡啶溴红染色可粗略估计其含量 琼脂糖凝胶电泳图 三 核酸含量的测定2 第五节核酸的变性 复性与杂交 一 变性二 复性三 杂交四 核酸序列分析 一 变性1 定义 指核酸双螺旋区氢键断裂 变成单链 它并不涉及共价键 磷酸二酯键 的断裂 变性因素 热变性 酸碱变性等 一 变性2 一 变性3 Tm值1 通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称该DNA的溶点或溶解温度 用Tm表示 DNA的Tm值一般在70 850C之间 变性的相对量 温度0C 60 80 100 1 0 1 2 1 4 1 6 0 Tm Tm Tm 100 Polyd A T Polyd G C DNA 一 变性3 Tm值2 Tm值的大小与下列因素有关 1 DNA的均一性 2 G C含量 3 介质中的离子强度 一 变性3 Tm值3 影响Tm值大小的因素1 1 DNA的均一性 一般均一性越高 Tm值的变动范围越小 2 G C含量 G C含量越高 Tm值越大 Tm与G C含量成正比关系 因为G C比A T更稳定 氢键 Tm与所含G C的多少的关系 可用经验公式计算不同DNA的Tm G C Tm 69 3 2 44 一 变性3 Tm值4 Tm与所含G C的多少有关 影响Tm值大小的因素2 一 变性3 Tm值5 3 介质中的离子强度 一般离子强度较低 DNA的Tm值也较低 范围也越窄 温度0C 70 80 100 1 2 1 4 1 5 90 1 1 1 3 A260 0 01 0 02 0 05 0 2 0 1 0 5 1 0 影响Tm值大小的因素3 大肠杆菌DNA在不同KCl浓度下的Tm 二 复性1 定义 变性DNA在适当条件下 又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构 高温变性 缓慢冷却 热复性 二 复性2 DNA复性后 许多物化性质又得到恢复 生物活性可以得到部分恢复 但将热变性的DNA骤然冷却 不能复性 只有缓慢冷却时才可以复性 高温变性 缓慢冷却 热复性 急速冷却 复性失败 二 复性3 影响因素 1 DNA浓度 浓度高时 两条互补链彼此相碰的机会增加 易于复性 2 温度 加热变性的DNA 当温度超过Tm后 如迅速冷却到低温时不能复性 但当溶液维持在Tm以下的较高温度时 则可复性 一般比Tm低250C左右时最佳 3 DNA片段大小的影响 大的线状单链 其扩散速度受到妨碍 减少了互补链的碰撞机会 三 核酸的杂交1 概念 两种来源不同 具有互补碱基序列的多核苷酸片段在溶液中冷却时 可以再形成双螺旋结构 称为杂交作用 DNA和DNA杂交以及DNA和RNA杂交在核酸技术中占有十分重要的地位 三 核酸的杂交2 一 核酸研究的主要工具酶 二 核酸的杂交技术 一 核酸研究的主要工具酶 1 核糖核酸酶类 RNA酶类 2 脱氧核糖核酸酶类 DNA酶 3 非专一性核酸酶类 1 核糖核酸酶类 RNA酶类1 1 牛胰RNA酶 RNaseA或RNaseI 2 RNA酶T1 RNaseT1 1 核糖核酸酶类 RNA酶类2 专一作用RNA 而不作用于DNA 其分子量14 000 最适pH7 0 8 2 十分耐热 具有高度的专一性 作用点为嘧啶核苷 3 磷酸与其他核苷酸之间的连键 生成3 嘧啶核苷或以3 嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸 南大P152 RNaseI RNaseI 1 牛胰RNA酶 RNaseA或RNaseI 1 核糖核酸酶类 RNA酶类3 比RNaseI更具有专一性 其作用点为鸟嘌呤核苷 3 磷酸与其他核苷酸之间的连键 产物为3 鸟苷酸或以其结尾的寡核苷酸 其分子量较小 耐酸耐热 RNaseI RNaseI RNaseT1 2 RNA酶T1 RNaseT1 2 脱氧核糖核酸酶类 DNA酶1 1 牛胰脱氧核糖核酸酶 DnaseI 2 牛胰脱氧核糖核酸酶 DNaseII 3 限制性内切酶 限制酶 2 脱氧核糖核酸酶类 DNA酶2 1 牛胰脱氧核糖核酸酶 DnaseI 此酶无碱基专一性 它切断双链DNA或单链DNA成为以5 磷酸为末端的寡核苷酸 平均长度为四个核苷酸 需Mg2 最适pH7 8 2 牛脾脱氧核糖核酸酶 DNaseII 也无碱基专一性 降解DNA成为以3 磷酸为末端的寡聚核苷酸 平均长度为六个核苷酸 最适pH4 5 需0 3mol L的Na 激活 Mg2 可以抑制此酶的活性 2 脱氧核糖核酸酶类 DNA酶3 1 是1979年 Arber Smith和Nathams等人在细菌体内发现的一类对DNA具有极高碱基专一性的内切酶 是DNA顺序测定 基因分离和基因体外重组等研究中十分重要的工具酶 这类酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA 但不降解自身细胞的DNA 一般识别顺序包含4 6个碱基对 3 限制性内切酶 限制酶 2 脱氧核糖核酸酶类 DNA酶3 2 大多数限制性内切酶的识别顺序具有回文结构 反向重复序列 3 限制性内切酶 限制酶 2 TTAGCACGTGCTAA AATCGTGCACGATT 反向重复 3 5 3 5 2 脱氧核糖核酸酶类 DNA酶3 3 大多数酶切割后形成粘末端 3 限制性内切酶 限制酶 3 GAATTC CTTAAG 3 5 3 5 EcoRI GAATTC CTTAAG 3 5 3 5 粘性末端 粘性末端 2 脱氧核糖核酸酶类 DNA酶3 4 少数酶切割后形成平整末端 3 限制性内切酶 限制酶 3 GTPyPuAC CAPuPyTG 3 5 3 5 HindII 平整末端 GTPyPuAC CAPuPyTG 3 5 3 5 3 非专一性核酸酶类1 1 蛇毒磷酸二酯酶 2 牛脾磷酸二酯酶 3 非专一性核酸酶类2 1 对RNA DNA都有作用 是从核苷酸链的3 羟基端开始 逐个切开5 核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键 得到5 核苷酸 1 蛇毒磷酸二酯酶 P P P H2O OH P P P OH OH 3 非专一性核酸酶类2 2 可作用RNA和DNA 是从5 羟基端开始 逐个切开3 核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键 得3 核苷酸 P P P H2O OH 2 牛脾磷酸二酯酶 P P OH P P P OH 二 核酸的杂交技术1 意义 核酸杂交可以在液相或固相上进行 是基因工程和分子生物学的重要技术之一 是鉴定阳性重组体 筛选基因 确定DNA的同源性 研究基因定位 组建DNA的物理图谱 研究DNA的间隔顺序等的有效手段 原理 核酸 DNA 的变性和复性的性质 也就是在带有互补顺序的同源单链间的配对过程中 DNA单链可重新形成双链 DNA单链也可与RNA互补成为杂交分子 因此有DNA类 DNA RNA类两种杂交 如把已知序列的分子预先用放射性同位素 32P 标记 称为探针 Probe 即可用其识别或 钓出 另一分子中的同源部分 二 核酸的杂交技术2 Southern印迹法 利用上述原理 1975年英国分子生物学家E M Southern首先发明的一种杂交 印迹法 此法是将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上后 再进行杂交具体方法参见北大P352 353 二 核酸的杂交技术3 1 1 将DNA样品经限制性内切酶降解后 用琼酯糖凝胶电泳进行分离2 将胶浸泡在碱 NaOH 中使DNA变性3 将变性DNA转移到硝酸纤维膜上 膜只吸附变性的DNA 4 800C烤4 6h 使DNA牢固地吸附在膜上 DNA DNA杂交实验法1 二 核酸的杂交技术3 2 5 与放射性同位素标记的 变性后的DNA探针进行杂交 此过程需要在较高的盐浓度及适当的温度 一般680C 下进行了几 十几个小时6 洗涤除去杂交标记物7 将膜烘干后进行放射自显影 DNA DNA杂交实验法2 二 核酸的杂交技术3 3 Northern印迹法 根据此原理 1977年G RStark建立了测定RNA的分子杂交技术 Westernbloting 用类似的方法 根据抗体与抗原可以结合的原理 开发了分析蛋白质的方法 DNA DNA杂交实验法3 四 核酸序列分析1 1965年RobertHolley首先用测蛋白质氨基酸的序列方法 重叠法 测定了酵母丙氨酸tRNA的序列 1977年两位学者提出了化学裂解法和双脱氧酶法 这两种方法的基本原理相同 都是用不同的专一性手段使被分析的DNA分子断裂成若干带放射性标记的 长短不一的片段 然后用测DNA片段的相对长度来测核苷酸的顺序 即利用凝胶电泳使各种片段分离 再用放射自显影法显影 从放射自显影 分子生物学中讲 图谱读出被测核苷酸的序列 具体参见北大P487 489 四 核酸序列分析2 1 待测序列 ATTAGACGTCCGTGCAATGC 3 5 双脱氧酶法测定DNA顺序1 引物及固定端 加引物 ACGTTACG 3 5 ATTAGACGTCCGTGCAATGC ACGTTACG 3 5 3