百合体细胞胚.doc

体细胞胚百合是世界四大切花之一，在世界上广泛栽培，深受人们喜爱。现在百合育种常用远缘杂交的方式进行新品种的选育，基因工程技术运用在百合育种是较少，主要是因为百合组培直接再生植株，转化率低，产生嵌合体多，不适宜大规模的育种工作。体细胞胚胎发生技术不仅使植物体的工厂化快繁成为现实 ，而且是为研究高效基因转化受体系统建立、种质保存、突变体筛选、人工种子研制、单倍体育种 、体细胞 胚 胎发 生与发育机理等方面提供了可能。途径：外植体鳞片-诱导再生成小植株-小鳞片或小叶片-诱导愈伤组织-鉴定为胚性愈伤组织-进行农杆菌的介导转化-检测-将转化后的胚性愈伤组织固体或悬浮培养诱导形成体细胞胚-再生得到转基因植株体细胞胚：在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚胎发生和发育过程，形成与合子胚相类似的结构，把这种类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。胚状体一般专指在组织培养条件下产生的非合子胚以区别于自然发生的珠心胚及其他通过无融合生殖和由合子胚分裂产生的胚（见多胚现象）。体细胞胚的界定：体细胞胚是离体培养的产物，与无融合生殖明显不同，只限于组织培养范围使用；体细胞胚起源于非合子细胞，；体细胞胚经历了胚胎发育过程，与器官发生形成个体的途径不同。体细胞胚形成的途径体细胞胚胎可分成直接途径和间接途径，绝大多数体细胞胚起源于单细胞。直接途径是从外植体某些部位直接诱导分化出体细胞胚。一般需要预胚胎决定细胞，即原来就存在于外植体中的胚性细胞。如柑橘属的珠心组织，胡萝卜的子叶表皮下细胞。例如龙牙百合以直接方式发生的体细胞胚, 起源于鳞片表皮下数层细胞或深层的细胞, 依次经过二分体、四分体、八分体、多细胞原胚, 球形胚, 心形胚, 成熟胚等阶段, 其形态学发育过程与合子胚相似。间接途径诱导外植体形成愈伤组织诱导愈伤组织胚性化体细胞胚形成愈伤组织表面和内部细胞均可产生胚状体。表起源 与内起源细胞悬浮培养-胚性细胞团-体细胞胚同步化的问题体细胞胚的起源：体细胞胚起源于单细胞。在多种植物中观察到单个胚性细胞，由不均等分裂的二细胞原胚和均等分裂的二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚、和子叶形胚的发育时期。如木豆。有时从同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合物上，可以观察到各个时期的体细胞胚，这是由体细胞胚发生和分裂不同步所致。在悬浮培养时可以采取措施使其同步化。体细胞胚建成与合子胚建成相比的特征：具有两极性存在生殖隔离遗传性相对稳定重演受精卵形态的特性胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织诱导体细胞胚关键是胚性愈伤组织的诱导形成影响胚性愈伤组织形成的因素很多，其内因主要是植物的基因型、外植体类型；外因主要是激素种类及其浓度、其它添加物，培养条件和培养方式等。1. 基因型 基因型是影响体细胞胚发生的重要因素，体细胞胚的诱导率和每个胚性外植体上体细胞胚的发生率因基因型而已。2. 外植体 外植体来源及生理状态不同，其体细胞胚发生能力不同。百合花丝、花梗、花托较为容易诱导出胚性愈伤组织。3. 激素因素 研究认为2,4-D是诱导多种植物离体培养体细胞转变为胚性细胞的重要激素，甚至是必须的激素，2,4-D在诱导胡萝卜的体细胞胚胚性细胞早期是必需的。2，4-D 促进IAA结合蛋白的形成 提高内源IAA含量 对单子叶植物而言，一般要求较高浓度的2,4-D，其浓度范围为0.55mg/L，通常使用浓度为2mg/L。2，4一D在诱 导胚状体 中具有 双重效应 ，它既能启动胚状体发生中胚胎蛋白合成的早期反应，又能阻止胚状体发 育成熟过 程 中的必需蛋 白质 的进 一步合成。2,4-D 阻碍直接胚细胞胚发生的途径，促进胚性愈伤组织的形成。NAA、Pieloram、Dicamb等都可以诱导体细胞胚的形成。ABA 的影响 ABA 对植物体体细胞胚的发生于发育具有重要作用，ABA对胚性愈伤组织的诱导有促进作用。乙烯抑制体细胞胚的发生。4. 其他的添加物 多胺类物质与体细胞胚的形成密切相关。适宜浓度的金属离子Co2+ 、Mn2+、 Cu2+ 对体细胞胚的诱导有促进作用。其机理可能是抑制乙烯形成酶的活性，抑制乙烯的的合成和促进多胺的合成。水解乳蛋白中的还原性氮对胚状体或不定芽的分化有促进作用。适量的加入活性炭能够提高体胚发生率。5. 培养方式以及条件 影响体胚诱导的培养方式主要有液体培养、固体培养、薄层切片培养，而培养条件主要是指光照条件、pH、温度等。百合体细胞胚诱导一般在暗中进行。光质的影响 分别用红光 蓝光 广谱光 白光等 分别诱导胚性愈伤组织和体细胞胚取诱导十天的绿白色脆弱的愈伤组织一克从含有2，4-D的半固态培养基上，加入到含有2,4-D和激动素的20ml液体培养基的锥形瓶中培养，放置在回旋振动器上，光周期16小时，温度25 每五天更换10ml新鲜培养基，作为在此培养。培养物用125uM的不锈钢滤网进行过滤，分离出单细胞和小细胞团。加入不同浓度的生长素，和过滤得到的培养物，在细胞悬浮培养期间用显微镜观察和统计细胞生长率。细胞生长率用PCV衡量，刻度离心管离心。基因类型基因表达时期产物相关功能管家基因Top-1EF-1aCEM-1H3-1CGS102CGS201鱼雷形胚球形胚球形胚或之前体细胞胚体细胞胚早期体细胞胚早期拓扑异构酶延伸因子-1a甘氨酸富集蛋白组蛋白谷氨酰胺合成酶原维管束细胞增殖促进细胞分裂促进细胞壁形成促进细胞分裂促进氮代谢信号转导基因SERKSwCDKCRKMsCPK胚感受态细胞球形胚体细胞胚体细胞胚早期体细胞胚发生的受体激酶钙依赖的蛋白激酶钙依赖的蛋白激酶类钙调素蛋白激酶确定体细胞胚发生钙信号转导钙信号转导钙信号转导生长素诱导基因DcArg-1pjCW1pjCW2胚性细胞诱导期短期胚性培养物短期胚性培养物脱落酸诱导基因DcECP63DcECP40DcECP31鱼雷形胚鱼雷形胚鱼雷形胚胚胎发生后期富集蛋白同源异型基因Soh 1CHB 1-CHB 6DcDB 1心形至鱼雷形胚球形和鱼雷形胚球形和鱼雷形胚转录因子染色质结合蛋白维管束形成胞外分泌基因EP 3-1EP 3-2EP 2DcAGP 1胚性细胞胚性细胞胚性细胞胚性细胞几丁质酶脂转移蛋白阿拉伯版半乳聚糖蛋白看护作用表皮形成细胞增殖、膨大和体细胞胚发育胚成熟基因Mat 1Dc 2.15Dc 3Dc 8DcEMB 1EmDcECP 31DcECP 40MsLEC 1MsLEC 2胚发育后期心形和鱼雷形胚发育后期胚发育后期胚发育后期胚发育后期胚发育后期胚发育后期胚发育后期胚发育后期胚胎发生后期富集蛋白凝集素胚干燥促进胚成熟胚成熟植物体细胞胚胎发生是一个复杂的发育过程, 研究者们通过分析植物体细胞胚发生过程中的基因表达或