药品的细菌（霉菌及酵母菌）计数检查技术课件

第六节药品的细菌 霉菌及酵母菌 计数检查技术 授课人 汪穗福 高级讲师 苏惠虹 助理讲师 广州市医药中专学校2005年3月 药品中细菌 霉菌及酵母菌 的计数检查是检测药物在单位重量或体积 克或毫升 内所含有的活菌数量 用以判断药品被污染的程度和标志 其内含是多义的 细菌数越多 表明药品受到致病菌污染的机会和可能性也较大 安全性也就越差 同时细菌数计数测定也包括药物的各种原料 工具设备 操作人员及工艺流程等各个环节的卫生状况和GMP评价的一个综合依据之一 由于中西药制剂中的各种剂型是非密封药品 不可能绝对无菌 药典规定允许一定数量的微生物存在 其主要标准见第三节内容 但均不能检出控制菌 药品中细菌 霉菌及酵母菌 的计数检查 中国药典 2005年版 规定为平皿法与薄膜过滤法两种方法 平皿法又称之为平板菌落计数法 该法是一种活菌计数法 测定结果只反映出在规定条件下生长的菌数 不可能包括在本条件下不生长或繁殖能力差的菌 因而测定数目可能低于实际的污染数 此外 测定中一个细菌可能繁殖成一个菌落 而一群也可能只形成一个菌落 以及污染的不均匀性等等原因 极易造成测定差异 故在测定时 必须严格按微生物限度检查所规定条件操作 同时在正式检查操作前要进行验证试验 以证实方法和操作的可靠性和可行性 具体详见第十二节内容 一 平皿法计数测定 一 细菌 霉菌或酵母菌计数的测定本法采用的是营养琼脂倾注平皿计数法 即取规定量的被检药品 以pH7 0氯化钠 蛋白胨缓冲液稀 需事先灭菌 稀释成不同比例的供试品稀释液 10 1 10 2 10 3 然后应分别吸取适宜的连续2 3个稀释度的供试品稀释液1ml置每一灭菌平皿中 不同稀释度至少制备2个 再于每一平皿中分别倾注15 20ml温度不超过45 的细菌 霉菌或酵母菌琼脂培养基 细菌用营养琼脂 霉菌用玫瑰红钠培养基 酵母菌用酵母浸出粉胨葡萄糖 均匀混和后 于30 35 培养48h后根据菌数报告规则计数 然后再将平均菌落数乘以稀释倍数 即可得每g或每ml被检药物中的细菌 细菌 霉菌或酵母菌总数 如超过一定的限量即可认为不合格 其测定过程如图7 1所示 菌数测定阴性对照试验取试验用的稀释剂1ml 置无菌平皿中 注入培养基 凝固 倒置培养 每种计数用的培养基各制备2个平板 均不得有菌生长 二 菌数计数与菌数报告规则1 计数除另有规定外 细菌培养48h 分别在24及48h点计菌落数 一般以48h的菌落数报告 霉菌 酵母菌培养72h 分别在48及72h点计菌落数 一般以72h的菌落数报告 必要时 可适当延长培养时间至5 7d进行菌落计数 菌落蔓延生长成片的平板不宜计数 点计菌落数后 计算各稀释级供试液的平均菌落数 按菌数报告规则报告菌数 若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15时 则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上 一般营养琼脂培养基用于细菌计数 玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数 在特殊情况下 若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌 玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌 则应分别点计霉菌和酵母菌 细菌菌落数 然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数 与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较 以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果 含蜂蜜 王浆的液体制剂 用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数 用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数 合并计数 2 菌数报告规则宜选取细菌 酵母菌平均菌落数在30 300之间 霉菌平均菌落数在30 100之间的稀释级 作为菌数报告 取两位有效数字 的依据 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定 以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数 当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时 视两者比值 比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值 而定 若比值不大于2 以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数 若比值大于2但不超过5时 以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告菌数 当出现比值大于5 或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时 应查明原因再行检查 必要时 应进行方法的重新验证 当各稀释级的平均菌落数均小于30 以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数 如各稀释级的平板均无菌落生长 或仅最低稀释级的平板有菌落生长 但平均菌落数小于1时 以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数 三 菌落计数 微生物限度 检查注意事项在进行药品菌落计数 微生物限度 检查时 要注意做到以下几点 药物在检验前 应保持包装的原有状态 不得开启 防止再污染 药物需放置于阴凉干燥处 防止微生物繁殖 以免影响检验结果 凡已将原包装启开者 应另行取样 供试品检验全过程必须符合无菌技术要求 使用灭菌用具时 不能接触可能污染的任何器物 灭菌吸管不得用口吸取 供试液从制备至加入检验用培养基 不得超过1h 否则可能导致微生物繁殖或死亡而影响计数结果 供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液 以免造成实验误差 为避免细菌菌落蔓延生长宜采用开盖干燥 倒置斜放超净台1 2h后合盖再培养 换陶瓦盖 加TTC 1000ml培养基加入1 TTC 三苯四唑氯化物 1ml 最终浓度为0 001 TTC可抑制菌大量生长 同时长出粉红色的菌落方法处理 二 薄膜过滤法计数测定这是 中国药典 2005年版 新规定采用的测控方法 应采用开放式薄膜过滤法 滤膜的孔径不大于0 45 m 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性 取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液1ml直接过滤 加至100ml稀释剂中 混匀 过滤 或取规定量的供试液直接或处理后 用pH7 0无菌氯化钠 蛋白胨缓冲液按10倍比稀释成1 102 1 103等稀释级 取适宜稀释级的供试液进行过滤测定 然后用无菌pH7 0氯化钠 蛋白胨缓冲液 或无菌聚山梨酯氯化钠 蛋白胨缓冲液 冲洗滤膜 每次冲洗量为100ml 冲洗次数同第十二节 二 方法的验证 平板上用于测定细菌数 菌面朝上贴于玫瑰红钠琼脂培养基用于测定霉菌数 菌面朝上贴于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上用于测定酵母菌数 每种培养基至少制备一张滤膜 然后分别置30 35 或23 28 培养 阴性对照试验取试验用的稀释剂1ml同法操作 作为阴性对照 阴性对照不得有菌生长 培养和计数同平皿法 每片滤膜上的菌落数应不超过100个 菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数 若滤膜上无菌落生长 以小于1报告菌数 每张滤膜过滤1g或1ml供试品 或小于1乘以稀释倍数的值报告菌数 一 中国药典 2005年版 一部 微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径 对患者健康潜在的危害以及中药的特殊性而制订的 药品的生产 贮存 销售及新药标准制订 进口药品标准复核 考察药品质量 仲裁及辅料等检验中 除另有规定外 其微生物限度均以本标准为依据 1 制剂通则 品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定 2 口服给药制剂2 1不含药材原粉的制剂细菌数每1g不得过1000个 每1ml不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得过100个 大肠埃希菌每1g或1ml不得检出 2 2含药材原粉的制剂细菌数每1g不得过10000个 丸剂每1g不得过30000个 每1ml不得过500个 霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得过100个 大肠埃希菌每1g或1ml不得检出 大肠菌群每1g不得过100个 每1ml不得过10个 2 3含豆豉 神曲等发酵成分的制剂细菌数每1g不得过100000个 每1ml不得过1000个 霉菌和酵母菌数每1g不得过500个 每1ml不得过100个 大肠埃希菌每1g或1ml不得检出 大肠菌群每1g应少于100个 每1ml应少于10个 3 3 局部给药制剂3 1用于手术 烧伤及严重损伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定 3 2用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂细菌数每1g或10cm2不得过1000个 每1ml不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g 1ml或10cm2不得过100个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌每1g 1ml或10cm2不得检出 3 3用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂细菌数每1g或10cm2不得过10000个 每1ml不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g 1ml或10cm2不得过100个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌每1g 1ml或10cm2不得检出 3 4眼部给药制剂细菌数每1g或1ml不得过10个 霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得检出 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌每1g或1ml不得检出 3 5耳 鼻及呼吸道吸入给药制剂细菌数每1g 1ml或10cm2不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g 1ml或10cm2不得过10个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌每1g 1ml或10cm2不得检出 大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂 每1g 1ml或10cm2不得检出 3 6阴道 尿道给药制剂细菌数每1g或1ml不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g或1mll应小于10个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 梭菌每1g或1ml不得检出 3 7直肠给药制剂细菌数每1g或1ml不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得过100个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌每1g或1ml不得检出 3 8其他局部给药制剂细菌数每1g 1ml或10cm2不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g 1ml或10cm2不得过100个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌每1g 1ml或10cm2不得检出 4 含动物组织 包括提取物 及动物类原药材粉 蜂蜜 王浆 动物角 阿胶除外 的口服给药制剂每10g或10ml还不得检出沙门菌 5 有兼用途径的制剂 应符合各给药途径的标准 6 霉变 长螨者以不合格论 7 中药取物及辅料参照相应制剂的微生物限度标准执行 二 中国药典 2005年版 二部 微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径 对患者健康潜在的危害以及中药的特殊性而制订的 药品的生产 贮存 销售及新药标准制订 进口药品标准复核 考察药品质量 仲裁及辅料等检验中 除另有规定外 其微生物限度均以本标准为依据 1 制剂通则 品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定 2 口服给药制剂细菌数每1g不得过1000个 每1ml不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得过100个 大肠埃希菌每1g或1ml不得检出 3 局部给药制剂3 1用于手术 烧伤及严重损伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定 3 2眼部给药制剂细菌数每1g或1ml不得过10个 霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得检出 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌每1g或1ml不得检出 3 3耳 鼻及呼吸道吸入给药制剂细菌数每1g 1ml或10cm2不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g 1ml或10cm2不得过10个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌每1g 1ml或10cm2不得检出 大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂 每1g 1ml或10cm2不得检出 3 4阴道 尿道给药制剂细菌数每1g或1ml不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g或1ml应小于10个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌每1g或1ml不得检出 3 5直肠给药制剂细菌数每1g不得过1000个 每1ml不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得过100个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌每1g或1ml不得检出 3 6其他局部给药制剂细菌数每1g 1ml或10cm2不得过100个 霉菌和酵母菌数每1g 1ml或10cm2不得过100个 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌每1g 1ml