饲用葡甘露低聚糖的酶法制取.doc

饲 用 葡 甘 露 低 聚 糖 的 酶 法 制 取摘 要：葡甘露低聚糖是一种重要的双歧因子，近年来已被作为一种功能性饲料添加剂，成为动物营养研究的新方向。试验通过对黑曲霉酸性 -甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备甘露寡糖进行条件研究，获得了以葡甘露低聚糖为主的酶解产物。酶解条件为：用煮沸的 pH 值 3.5 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制 180 g/l 的魔芋粉溶液，加酶量按 30 IU/g 魔芋粉计算，酶解水浴温度为 65 ，酶解时间为4 h。酶解结束后，将酶解液进行高温灭菌并接种酿酒酵母进行发酵，发酵温度为 30 ，摇床转速200 r/min，发酵 20 h 后将发酵液离心，所得上清液即为不含单糖的葡甘露低聚糖，得率可以达到35.73%（以魔芋粉计）。关键词：葡甘露低聚糖；-甘露聚糖酶；魔芋粉葡甘露低聚糖是双歧杆菌和乳酸菌最好的生长因子之一，除具有一般低聚糖的双歧因子功能外，尚具有吸附、排除人和动物肠道病原菌，调节免疫功能，增强人和动物非特异性免疫活性，促进肝脏合成甘露糖结合蛋白等独特的生理功能。近年来已被作为一种功能性饲料添加剂，成为动物营养研究的新方向(张力华等，2006) 。葡甘露聚糖是魔芋块茎特有的主要成分，是由 d-葡萄糖和 d-甘露糖按 1： 1.6 摩尔比以 -1，4 糖苷键连接的杂多糖，其含量约为 44%64%。-甘露聚糖酶是一类能够水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的内切酶，-甘露聚糖酶水解植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶和魔芋等)可生成低聚甘露糖，引起了国内外食品、医药、动物饲料添加剂等领域的兴趣。文中对 -甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备葡甘露低聚糖的条件进行研究。1 材料与方法1.1 酸性 -甘露聚糖酶的来源黑曲霉 Aspergillus niger MA-56 由本课题组筛选分离获得，为酸性 -甘露聚糖酶高产菌株（李艳丽等，2009；许少春等，2009）。发酵培养基（以 10 g 干基为标准）：麸皮 8 g、豆粕 2 g、魔芋粉 0.1 g。发酵条件为：固形物与加水比 10： 9，接种孢子悬浮液 2.5 ml（以一支菌种斜面加 30 ml 无菌水为标准），300 ml三角瓶中装量 7 g 培养基，发酵 56 h 时，产酶量达到1 200 IU/g。1.2 粗酶液的制备将发酵好的培养物于 40 鼓风烘干，并用高速粉碎机磨成细粉。称取固体酶样 8 g，加入 100 ml 蒸馏水，40 抽提 1 h，用滤纸过滤，得到酸性 -甘露聚糖酶粗酶液，酶活力达 100 IU/ml。1.3 材料和试剂麸皮、豆粕等发酵主原料由富阳新发生物技术有限公司提供；魔芋精粉购自武汉市强森魔芋食品有限Abstract：Oligo-glucomannan is a kind of important bifidus factor, it has been applied to animal feedadditive field. Konjak powder can be hydrolyzed to oligo-glucomannan by -mannanase. The optimalenzymatic condition for oligo -glucomannan production was: 180 g/l of konjak powder, 30 IU/g of -mannanase, and then incubated at 65 for 4 h. The enzymatic hydrolysate was fermentated at 30 for20 h by saccharomyces cerevisiae. Oligo -glucomannan production was reached 35.73 g/100 g konjakpowder.Key words：oligo-glucomannan；-mannanase；konjak powder试 验 研 究饲料工业2011 年第 32 卷第 2 期47公司；纯硅胶板 60F 254 为德国默克公司产品。1.4 魔芋粉水解率的测定将适量的 pH 值 3.5 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加热煮沸，直接加入称好的魔芋粉中，不断搅拌至魔芋粉溶解，配成不同浓度的魔芋粉溶液。向魔芋粉溶液中加入一定活力单位的 -甘露聚糖酶液（加酶量以 IU/g 魔芋粉计），于 65 水浴中酶解一定时间，酶解结束后酶解液经煮沸 10 min 灭酶、离心，取上清液适当稀释后，用 DNS 法测定酶解液中的还原糖量（以甘露糖计）。魔芋粉水解率为：魔芋粉水解率（%）= 酶解物还原糖量（g）100/魔芋粉量（g）。1.5 酶解产物中单糖的去除及葡甘露低聚糖得率的测定酶解产物中单糖的去除是利用酵母发酵法，依据的原理是葡甘露低聚糖的难发酵性，选用合适的酵母将酶解产物中的甘露糖和葡萄糖等可发酵性单糖去除，从而提高葡甘露低聚糖的纯度。葡甘露低聚糖的得率为经酵母发酵将可发酵性单糖完全去除后，取发酵产物适当稀释后，用 DNS 法测定发酵液中的还原糖量，计算公式为：葡甘露低聚糖得率（%）= 发酵产物还原糖量（g）100/魔芋粉量（g）。1.6 酶解产物定性检测魔芋粉酶解液经煮沸灭酶、离心，取上清液点样至硅胶板上，于 V(正丁醇)V(冰乙酸)V(水)=211 的展层液中展层 34 h，喷洒苯胺-二苯胺-磷酸显色(80 、15 min)。1.7 数据处理每组试验重复处理三次，结果取平均值。运用Statistica5.5 软件对数据进行统计分析，并在 0.05 水平上进行显著性检验。2 结果和讨论2.1 Co60 辐照对魔芋粉水解率的影响有研究表明（张盛林等，2003），将魔芋粉放入辐照场，用 10 000100 000 伦琴的 Co60 射线照射后，即可使魔芋粉粘度下降 30%90%。本试验将魔芋粉置辐照场经 Co60 照射，照射剂量分别为 4 万、6 万、8万和 10 万伦琴，研究 Co60 辐照对魔芋粉水解率的影响。魔芋粉初始浓度设为 20 g/l，酶解过程用酶量初定为 50 IU/g 魔芋粉，酶解温度 65 ，酶解时间 4 h，结果见表 1。表 1 Co60 辐照对魔芋粉水解率的影响69.460.13a47.30.65a89.240.07a46.20.35a109.420.10a47.10.50aCo60 剂量（万伦琴）项目还原糖量（g/l）水解率（%）09.430.11a47.150.55a49.390.17a46.950.85a注：试验数据为三次重复的平均值标准误，表格中同一行处理间平均数差异显著性用邓肯氏多重检验法，数字肩标相同小写字母表示差异不显著（P0.05），不同小写字母表示差异显著（P0.05）。 下表同。表 2 魔芋粉初始浓度对魔芋粉水解率的影响16079.882.8549.931.78b18090.482.4550.261.36b19091.24 1.4848.02 0.78a魔芋粉浓度（g/l）项目还原糖量（g/l）水解率（%）10050.082.0450.082.04b14070.502.3250.361.66b20092.13 1.8146.06 0.91a从表 1 可以看出，经 Co60 辐照对魔芋粉的水解率没有任何影响，其粘度在肉眼范围内也未见降低。2.2 魔芋粉初始浓度对魔芋粉水解率的影响魔芋粉溶解后分子链伸展，黏度非常大，高浓度的魔芋粉都呈凝胶状，浓度再增加还有可能形成“包胶块”，阻止酶对它的水解作用。魔芋粉初始浓度对魔芋粉水解率的影响见表 2。酶解过程用酶量初定为50 IU/g 魔芋粉，酶解温度 65 ，酶解时间 4 h。许少春等：饲用葡甘露低聚糖的酶法制取试 验 研 究由表 2 可见，随魔芋粉浓度增加，还原糖量不断增加，而魔芋粉水解率变化不大，但当魔芋粉浓度达到 190 g/l 时，水解率明显开始降低，原因可能是由于随着魔芋粉浓度的增加，其粘度不断增加，阻碍了酶对魔芋粉的酶解作用。而文献中报道(李剑芳等，2007)的魔芋粉浓度最高达到 150 g/l 时，水解率就开始下降。2.3 发酵去除酶解产物中单糖的培养基的选择从本实验室选择了酿酒酵母为发酵法去除酶解48产物中单糖的候选菌株，并对发酵过程中氮源的添加与否进行了试验。培养基 1：待处理的魔芋粉酶解液；培养基 2：在待处理的魔芋粉酶解液中添加酵母膏2.0 g/l、蛋白胨 4.0 g/l，自然 pH 值。培养基 115 灭菌20 min，冷却后接种一环新鲜酵母，置 30 恒温摇床上 150 r/min 培养 20 h。魔芋粉初始浓度设为 100 g/l，酶解过程用酶量初定为50 IU/g 魔芋粉，酶解温度65 ，酶解时间 4 h，结果见表 3。表 3 不同培养基对单糖利用的影响发酵前还原糖量(g/l)50.082.0450.082.0412培养基50.082.0450.082.04水解率(%)发酵后还原糖量(g/l)34.700.68a34.610.41a30.7130.89相对降低量（%）从表 3 可以看出，培养基中添加氮源与否对发酵过程中还原糖的降低量没有影响。将酵母发酵前后的酶解液进行硅胶板薄层层析检测（见图 1）。由图 1 可见，酿酒酵母发酵后单糖斑点消失，说明酿酒酵母发酵 20 h 能有效地去除酶解液中的可发酵性单糖，且发酵培养基可直接为待处理的魔芋粉酶解液。图 1 酶解液发酵前后薄层层析2.4 酶解时间对魔芋粉水解率和葡甘露低聚糖得率的影响表 4 酶解时间对魔芋粉水解率和葡甘露低聚糖得率的影响酶解时间(h）123456发酵前还原糖量(g/l)40.000.57a46.540.96b49.780.48c56.530.93d56.180.53d56.471.41d发酵后还原糖量( g/l)26.44 0.63a29.13 0.23b32.17 0.14c33.02 0.27d32.80 0.52d33.38 0.59d低聚糖得率(%)26.440.63a29.130.23b32.170.14c33.020.27d32.800.52d33.380.59d40.000.57a46.540.96b49.780.48c56.530.93d56.180.53d56.471.41d水解率(%)采用 100 g/l 的魔芋粉溶液，加酶量按 50 IU/g 魔芋粉计算，酶解水浴温度为 65 ，酶解时间分别为 16 h。酶解结束后，将酶解液离心，取上清液进行高温灭菌并接种酿酒酵母进行发酵。结果见表 4。从表 4 可以看出，在加酶量为 50 IU/g 魔芋粉的情况下，随着酶解时间延长，魔芋粉水解率和葡甘露低聚糖得率都有所提高，但 4 h 后水解率和低聚糖得率就达到一个稳定值，不会再随酶解时间延长而提高，这可能是因为水解达到了平衡，酶解产生的还原糖对酶解过程产生了反馈抑制作用。2.5 加酶量对魔芋粉水解率和葡甘露低聚糖得率的影响采用 100 g/l 的魔芋粉溶液，酶解水浴温度为65 ，酶解时间为 4 h。用酶量按照酶解结束后，将酶解液离心，取上清液进行高温灭菌并接种酿酒酵母进行发酵。结果见表 5。表 5 加酶量对魔芋粉水解率和葡甘露低聚糖得率的影响酶解酶量(IU/g 魔芋粉)102030405060发酵前还原糖量(g/l)46.200.33a58.250.51b62.210.55c61.370.62c61.500.87c61.351.03c低聚糖得率(%)30.570.12a34.330.34b35.730.24c35.670.52c35.630.42c35.870.34c46.200.33a58.250.51b62.210.55c61.370.62c61.500.87c61.351.03c水解率(%)发酵后还原糖量(g/l)30.570.12a34.330.34b35.730.24c35.670.52c35.630.42c35.870.34c从表 5 可以看出，在酶解 4 h 的条件下，加酶量达到 30 IU/g 魔芋粉时，魔芋粉水解率和葡甘露低聚糖得率均达到最高值，分别为 62.21%和 35.73%，再增加用酶量，并没有产生更好的任何效果。3 结论用煮沸的 pH 值 3.5 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制 180 g/l 的魔芋粉溶液，加酶量按 30 IU/g 魔芋粉计算，酶解水浴温度为 65 ，酶解时间为 4 h。酶解结束后，将酶解液离心，取上清液进行高温灭菌并接种酿酒酵母进行发酵，发酵温度为 30 ，摇床转速200 r/min，发酵 20 h 后将发酵液离心，所得上清液即为不含单糖的葡甘露低聚糖，得率可以达到 35.73%。参考文献1 李艳丽，许少春，柳永，等. 黑曲霉MA-56 -甘露聚糖酶的生产条件研究J. 中国饲料, 2009（16）: 11-14.2 李剑芳，邬敏辰，程科，等. -甘露聚糖酶制备魔芋葡甘露低