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下一代测序技术摘要：DNA测序技术对生物学的发展有着最根本的意义。Sanger法测序经过了30年的应用和发展，而在过去三年中，以454, solexa, SOLiD为代表的高通量测序平台已经大幅度降低了测序成本，提高了测序速度，成为基因组测序市场的主流。在此基础上，各种下一代测序技术正在快速研发，将使基因组测序和重测序的通量和成本更加平民化，为基因组学、遗传学、生物医学和健康科学等领域的发展创造更加广阔的前景。本文将对所有新的测序技术的原理、优势和应用进行总结和展望。1977年Maxim、Gilbert发明的化学降解法测序技术和Sanger发明的双脱氧末端终止法测序技术不仅为他们赢得了诺贝尔奖，也使得从DNA序列层面研究分子遗传学成为可能。特别是后者，从最开始的凝胶电泳到越来越高通量的毛细管电泳，从开始的手工操作到越来越多自动测序仪的出现，各种改进的Sanger测序技术统治了DNA测序领域三十年，至今仍在长片段测序，大片段文库测序方面有广泛的应用。人类基因组计划（HGP）的完成就是靠Sanger测序法。在耗费了庞大成本的人类基因组计划宣布完成之后，越来越多的物种基因组测序工作对测序成本和通量提出了更高的要求，新一代测序技术（也被称为第二代测序技术）开始登上历史舞台。2005年454 life science公司率先推出了焦磷酸测序技术，使测序成本较Sanger法降低了100倍，速度快了（提高）100倍，人类基因组测序逐步进入了100，000美元时代。如今，454 FLX测序仪（Roche Applied Science）、基于“边合成边测序”的Solexa测序仪(Illumina Inc.)和使用“边连接边测序”的SOLiD测序仪(Applied Biosystems)已经成为基因组测序市场的主流机型。除此之外，2008年一年内又有HeliScope单分子测序仪（Helicos）和Polonator(Dover/Harvard)两种测序机型商品化。在NHGRI（美国人类基因组研究中心）的支持和推动下，未来几年内测序成本将在目前基础上再下降100倍，最终使个人基因组测序成本降至1000美元，人类将革命性的进入个人基因组时代。高通量和低成本的测序技术将进入到普通实验室，基因组测序的简单化将使分子生物学飞跃发展，个人基因组测序产业化也将对健康医学等领域产生革命性的影响。本文将首先对目前已经商品化的新一代测序技术（454、Solexa、SOLiD、HeliScope）做一介绍和比较，再对正在研发中的各种下一代测序方法（第三代测序技术）的原理和应用做一详细的介绍和展望。1. Roche 454测序技术 2005年454生命科学公司在自然杂志发表论文，介绍了一种区别于传统Sanger法的全新高通量测序方法，将测序成本降低了100倍以上，开创了第二代测序技术的先河，454测序仪也成为最先商品化的第二代测序仪。正是在此基础上，其它如Solexa、SOLiD等第二代测序仪才相继问世。454测序技术的原理在于首先使用乳液PCR（emulsion PCR）技术（图一a）扩增已经连接上接头的基因组文库片段，扩增子结合在28 m的磁珠表面，将乳液破坏后用变性剂处理磁珠，再将含有扩增子的磁珠富集到芯片表面，用测序引物进行测序。在测序过程中，454使用了一种“焦磷酸测序技术”（Pyrosequencing），即在合成DNA互补链的过程中，每加入一种单核苷酸（dNTP），如与模板链配对结合，就会释放出一个焦磷酸，与底物腺苷-5-磷酸硫酸（APS）在ATP硫酸化酶作用下合成ATP，与荧光素（Luciferin）一起在荧光素酶(Luciferase)的作用下，会发出一个光信号，由芯片背后连接的电荷耦合装置（CCD，Charge Coupled Device）捕捉。 454测序技术合成DNA链使用的是普通单核苷酸，没有任何标记，合成中也没有切割基团等生化反应，因此读长可以达到300-400bp。但没有阻断（block）和去阻断（de-block）过程也意味着对连续重复单核苷酸的阅读只能根据信号强度来判断，容易对其中插入和缺失碱基阅读错误。454测序技术相比较其他第二代测序技术如Solexa和SOLiD, 在读长上有着巨大的优势，但是目前成本要略高。总体而言，高读长使得454技术比较利于De Novo拼接和测序。 焦磷酸测序原理（Pyrosequencing）2. Illumina Solexa测序技术 2006年包括Illumina和Solexa在内的四家公司合作开发出了一种基于“边合成边测序”（Sequence By Synthesis）原理的新测序技术。这种测序仪后来被成为Illumina Genome Analyzer，即通常所说的Solexa测序仪。与454测序技术不同的是，Solexa测序样品制备用“桥式PCR”（Bridge PCR）技术（图一b）在芯片（Flow Cell）上扩增DNA，生长DNA簇（Cluster）。芯片上的每个DNA簇都包含成千上万单克隆扩增子。以每个DNA单链为模板，互补逐个合成DNA第二链。每种单核苷酸的碱基上都有特异荧光标记，3-羟基上有可逆的阻断（block）基团。每连接上一个单核苷酸的循环中，都有CCD拍摄、切割荧光集团和去阻断(de-block)的过程。Solexa技术通过四通道拍摄不同荧光来确定合成的碱基种类，从而确定DNA序列。这种“边连接边测序”的特点在于，由于在合成过程中引入多步生化反应，使得读长较短（35bp），但通量更大。虽然较短的读长给拼接造成了困难，不利于De Novo测序，但在一些对读长要求不高的应用（如重测序）中有得天独厚的优势。3.AB SOLiD测序技术 与454技术类似，SOLiD测序也采用体外乳液PCR（emulsion PCR）来扩增DNA文库，扩增子结合在1m的磁珠表面。SOLiD测序技术的核心在于一种“边连接边测序”技术（Sequencing By Ligation），使用DNA连接酶而非聚合酶，将8个核苷酸的随机探针在模板上与测序引物连接，八核苷酸探针的前5个碱基随机，共1096个。其中检测的第4、5个碱基用特异荧光标记，通过5轮的反应与特殊的信息解读，就可以将一定长度的末端序列读出。SOLiD测序与Solexa测序相似的是读长短（36bp），芯片通量大，成本也类似。但是SOLiD特殊的双碱基读谱对信息分析的要求较高，在SNP检测上有着独有的优势，而且理论上错误率比454技术和Solexa技术更低。图一a. 乳液PCR ( emulsion PCR )b. 桥式PCR ( bridge PCR )4.HeliScope测序技术 2008年商品化HeliScope测序仪是由Helicos公司的开发的单分子测序仪。由于上机前不需要对文库进行任何扩增，因此是第一台真正意义上的单分子测序仪(tSMS, true Single Molecular Sequencing)。和其它第二代测序仪类似，Helicos技术首先将基因组DNA打断成100bp-200bp的片段。然后将片段的3端连接上标记Cy3荧光分子的多聚A尾巴（Poly A tail）,与芯片（Flow Cell）上连接的数十亿条Poly T寡聚核苷酸退火杂交，从而被原位固定在芯片上。HeliScope的测序原理采用的是单分子“边合成边测序”，在DNA聚合酶的作用下，Cy5分子荧光标记的单核苷酸依次互补合成在模板上，每一轮反应经过洗涤、原位拍摄、切割荧光分子一系列过程确定碱基种类，再进入下一轮反应。Helicos通过一系列电子技术和荧光能量共振转移（FRET）技术，提高了CCD的信噪比和检测灵敏度，从而真正达到了单分子信号检测，读长可以达到25bp以上。HeliScope测序在每一轮反应中没有如Solexa那样引入阻断（block）和去阻断（de-block）过程，因此面临和454类似的问题，即如何区分同聚序列（Homopolymers），然而，Helicos的单分子检测使它避免了这个问题，即可以通过降低核苷酸合成速率的方法。事实上，Helicos发现连续的合成相同的标记核酸产生的淬火作用能够区分同源多聚核酸的数目。 HeliScope测序原理5新一代测序技术的优势和挑战 与传统Sanger法测序相比，包括Roche 454、Illumina Solexa、AB SOLiD和Helicos在内的第二代测序技术既在测序速度和成本上有着巨大的优势，也在读长和错误率方面依然存在着挑战。前面已经提到，Sanger测序法在今天仍然有着新测序技术不可比拟的优势，在某些测序应用方面仍然有广泛的应用。因此，我们必须灵活发挥这两代测序技术的优势，根据测序应用的特点决定使用哪种方法，在必要时将两类方法结合起来，以期最高效最方便的完成测序任务。 第二代测序技术的优势很明显，主要包括以下几个方面：1. 在文库构建方面，新技术抛弃了Sanger法的体内扩增，采用了诸如乳液PCR或桥式PCR等体外扩增方法，甚至如Helicos的单子分测序，根本不需要扩增就能达到信号检测的灵敏度。这大大简化了文库构建的操作，避免了克隆构建、转化等繁琐操作，极大的提高了效率，加快了测序速度。2. 第二代测序技术从大规模提高通量和微量化反应体系入手，将测序成本大大降低了。尽管Sanger测序法也在努力寻求在芯片上大规模集成毛细管电泳以实现更大通量的方法，但是，第二代测序技术不需要电泳，这就轻松突破了提高通量的瓶颈。现在，已经能做到在一块芯片（flow cell）上集成上亿的反应体系，这是Sanger法远远不能达到的，并且，随着电子技术的进步，通量还会继续提高。通量的提高不仅降低了成本，也提高了测序速度。另一方面，由于芯片上反应体系的微量化，在最大程度上减少了反应试剂的用量，与Sanger法相比，这是成本降低的重要方面。正是出于上述原因，新测序技术的速度比Sanger法快了100倍，成本也降低了100倍。 尽管如此，就目前而言，第二代测序技术所面临的问题也不容忽视。第一，读长问题。几种新技术中只有使用焦磷酸法测序的454技术读长能够达到300bp左右，其它所有技术的读长都只有几十个碱基。而Sanger法的读长目前已经可以轻松达到几千个碱基。短读长虽然在某些应用（比如表达谱）上有优势，但在全基因组de novo测序，重测序等基本应用方面，短读长给数据处理和拼接造成了很大困难。目前，所有第二代测序机型都在为提高读长努力。但是，由于测序原理方面的局限，提高读长往往会带来第二个问题，即读错率。就目前读长而言，新测序技术的单碱基读错率比传统Sanger法至少高出十倍，并且会随着读长加大而提高。虽然通过数据分析的手段可以减少由于读错带来的错误，使测序结果的错误率低于万分之一，但在提高读长的同时降低错误率仍然是第二代测序平台努力的方向。 基于以上分析，就目前情况而言，传统Sanger法仍然在小规模的测序应用上（比如质粒等，从几十个碱基到百万碱基）有很大市场，毕竟这些应用在读长和准确性方面的要求高，而新技术的高通量和低成本发挥不出明显的优势。而在大规模基因组测序上，尽管有如上所述的挑战，新一代测序技术在成本和效率方面的优势实在太过突出，将会发挥主要作用，并且这种技术在未来数年还有很大改进提高的空间。在De novo全基因组测序上，将依赖新测序平台的“双向测序”（pair-end，即从片段两端测序）和Sanger法的长片段测序，将两种方法结合将会收到更好的效果。因此，我们目前应该根据不同任务的特点选择合适的方法。454、Solexa和SOLiD三种新一代测序技术有其相似之处：都需要对样品进行体外扩增，都将扩增子大规模原位杂交在芯片上通过CCD拍摄来检测荧光信号，因此，也被统称为循环芯片测序技术（Cyclic array sequencing）。Helicos单分子测序除了不需要进行扩增，其它过程也类似。各种不同的新一代测序技术也有自身的特点，总结在表一。第一，454、Solexa、SOLiD测序平台在测序前要进行PCR扩增，Solexa采用了比较特殊的桥式PCR扩增，而HeliScope测序仪由于提高了检测灵敏度，不需要扩增。第二，454平台的读长远高于其它平台。第三，在读错率方面，由于测序原理的差异，各种平台的读错类型不同。454和HeliScope对同聚序列的识别使其主要对单碱基的插入和缺失（indel）易读错，不同于其它平台的碱基替换(Substitution)错误。并且，SOLiD的读错率低于454和Solexa, 而HeliScope最低。第四，在数据分析方面，SOLiD技术由于其特殊的“双碱基解码”原理（2 base encoding）,能够有效识别SNP位点并降低读错率，但必须使用特有的分析软件，提高了分析难度，而其它平台可以采用统一的软件。第五，从单碱基成本来看，454较高，Solexa相对较低，其它平台处在相似的水平。最后，从样品制备来看，使用乳液PCR过程要比桥式PCR繁琐，而HeliScope由于没有PCR过程，样品制备最为简单快捷。平台测序原理PCR类型一个run通量（reads）一个run的有效数据量（MB）一个run的时间是否支持双向测序(PE,Pair end)Roche 454边合成边测序乳液PCR400，000100（SE）7.5小时（SE）是Illumina GA边合成边测序桥式PCR50,000,000?10,000(PE)6天（PE）是AB SOLiD边连接边测序乳液PCR400,000,00011,000(PE)6天（PE）是HeliScope边合成边测序不需要PCR1,000,000,00060,000（PE）14天（PE）是平台读长Pair end样品制备时间每百万碱基成本（$）仪器价格（$）读错率读错类型Roche 454300-400bp23小时60500,0000.01%插入缺失Illumina GA36-45bp2天2430,0000.01%替换AB SOLiD35bp7.5天2591,0000.001%替换HeliScope30bp未知11,350,0000.001%缺失 表一 主要新一代测序平台的比较6. 新一代测序技术的应用 新一代测序技术大大加快了测序速度，同时降低了成本，在许多研究领域得到了广泛的应用。其中包括：全基因组de novo测序（whole genome de novo seuqencing），全基因组重测序(whole genome reseuquencing)，基因组目的区域重测序(targeted genome resequencing)，小RNA测序(small RNA profiling)，基因表达谱测序（gene expression profiling），转录组测序（transcriptome sequencing），DNA甲基化（methylation）大规模检测，用染色质免疫共沉淀法（Chip-Seq）绘制基因组DNA-蛋白相互作用图谱，生物群体基因组检测（metagenomics），基因拷贝数变异（copy number variation）等。相信在未来数年里，新测序技术的应用将更加广泛。7. 其它正在研发中的下一代测序技术7.1 杂交测序技术（SBH, Sequencing by Hybridization）早在1989年前南斯拉夫人Rade Dramanac就在Genomics上提出了杂交测序技术的构想和相关细节，后来将此技术应用在检测p53基因变体序列，探索了其在分子诊断方面的应用。杂交测序技术的核心在于使用包含全部序列的一定大小的寡聚核苷酸探针（比如512条五核苷酸探针，2048条六核苷酸探针），与固定在芯片表面的基因组片段杂交。由于每条探针都有荧光标记，就能得到每个基因组片段对所有探针的荧光条码（即能与哪些探针杂交），通过分步组装，先用探针序列拼接基因组片段，再将片段组装成整个基因组。最近，有研究小组应用此杂交测序技术，成功组装了-噬菌体（48502bp）和大肠杆菌（4.6 Mbp）的基因组。他们将基因组打断成200bp的片段，连接上接头后环化，原位杂交在连有与接头互补序列的芯片上，并在芯片上进行滚环复制扩增（Rolling Cyclic Amplification）。然后，使用582条五核苷酸荧光标记探针，依次与芯片进行杂交、洗涤、用CCD检测荧光信号和洗脱。记录下每条片段的荧光条码（light barcode）,最后进行分步组装。研究者用27的数据量，成功覆盖了95%的大肠杆菌基因组，准确率达到99.94%。以此证明了杂交测序技术在大规模基因组测序方面的潜力。一直以来，杂交测序技术最大的挑战在于，第一，有研究表明含有k个寡核苷酸的探针只能拼接2k长短的片段（即五核苷酸探针最大拼接32bp片段）；第二，杂交测序对重复序列拼接困难重重；第三，信息处理要求高，难得到更大覆盖度。对于前两点的确使SBH技术在de novo测序上遇到了困难，但是对于重测序就不是问题。SBH成本要远远低于其它第二代测序平台，由于杂交不需要任何酶促生化反应的参与，试剂成本大大降低，只有少量的探针合成成本，也能达到很大通量。SBH将在重测序方面有很光明的前景。事实上，美国的Complete Genomics公司已经提出了基于SBH的5000美元个人基因组项目。他们使用高通量的芯片（单张芯片达到上亿通量）在芯片表面纳米球上扩增DNA片段，使用“组合探针锚定连接”技术（combinational probe-anchored ligation）对片段两端的35个碱基进行双向测序（pair end）。从很多角度看来，这种SBH技术与前面提到的“循环芯片测序”（cyclic array sequencing）很相似，都是将DNA片段原位固定在高通量芯片表面进行扩增，再用CCD拍摄荧光信号。区别仅仅在于基于碱基聚合、连接还是杂交原理来进行每一轮反应。除此以外，SBH还有另一种思路，即将探针连接在芯片上，与待测序列原位杂交，来检测插入、缺失和替换等突变位点。许多芯片公司已经以此原理开发了SNP芯片等。7.2 实时测序技术（real time sequencing）单分子实时测序的原理是，在DNA合成过程中，以DNA聚合酶作为一个纳米机器，随着聚合酶在模板链上的移动，捕捉每个合成的荧光标记的碱基信号。首先，将每种单核苷酸都标记上不同的荧光分子，荧光分子标记在5-磷酸基团上，而并非碱基上。当某种核苷酸与模板链配对结合时，就会在DNA聚合酶处发出荧光信号，从而达到边合成边测序的目的，信号捕捉完毕，就会切割荧光基团，成为正常的核苷酸，再继续反应。其次，实时测序不需任何PCR扩增，是真正的单分子测序。由于反应体系中有很多荧光标记的单核苷酸，实时测序的核心在于如何从很强的荧光背景中检测结合上的核苷酸荧光信号。对此，两家不同的美国公司采用了不同的方法。Visigen公司使用了荧光共振能量转移（FRET）技术，使用了荧光标记的DNA聚合酶，由于只有结合到模板的单核苷酸上的荧光分子才能与聚合酶中的荧光分子足够接近，产生FRET作用，从而发出强于背景的荧光信号。而Pacific Bioscience公司使用一种被称为零模式光导（zero mode waveguide）的纳米小室作为DNA合成的反应体系，这个反应空间直径只有70nm，足够小的空间将单核苷酸荧光背景与结合上模板的核苷酸荧光信号区分开，从而实现了足够的检测信噪比。这些纳米小室在芯片上阵列，实现了高通量。Pacific Bioscience公司已经在最近的文章中证明了这种技术的可行性和进展。由于合成上的都是正常的核苷酸，这种技术可以实现比Sanger法更长的读长。并且碱基合成速度达到每秒10个，加上芯片的高通量，单分子实时测序可以很轻易的实现高速度和低成本。目前，这种技术还处在研发阶段，Visigen公司希望最近的几年将产品推向市场，并在2010年左右实现1000美元测序人的基因组。7.3 纳米孔测序技术（Nanopore Sequencing） 纳米孔测序技术是近年来发展最快，最热门的领域之一。很多研究者认为，这是在未来几年内最有希望实现1000美元个人基因组项目的下一代测序技术。美国人类基因组研究中心（NHGRI）2008年批准的8个1000美元基因组项目中，有5个与此相关。 当在充满电解液的纳米级小孔两端加上一定的电压时（比如100 mV），通过此纳米孔的电流强度很容易测定。当纳米孔的直径恰好只能容纳一个核苷酸通过时，长链核酸（DNA或RNA）在电场作用下就会依次通过此纳米孔。纳米孔一旦被核苷酸阻断（block），通过的电流强度就会变弱。而且由于四种不同核苷酸碱基的差异导致的空间构象差别，纳米孔被阻断时电流变小的程度不同，四种碱基分别有其特征的电流峰值。在DNA依次通过纳米孔时检测相应的电流来判断对应的碱基，就能够实现测序，这就是纳米孔测序技术的基本原理。与传统Sanger法和第二代测序技术相比，纳米孔测序的优势显而易见：低成本、高速度和高通量。纳米孔测序过程中不需要任何生化反应的参与，几乎不需要任何试剂成本，只有样品制备、设备折旧和纳米孔芯片的成本，这将大大优于大多数第二代测序技术。在电场作用下DNA通过纳米孔的速度决定了测序速度，而在120 mV电压下通过速率达到1-20 s/核苷酸，这意味着理论上一个纳米孔就可以达到百万碱基每秒的测序速度，非常惊人。如果能在一张芯片上阵列大量的纳米孔，就能轻松达到高通量测序。此外，纳米孔测序还具有需要样品量少，超高读长的优点。由于不需要任何聚合或连接反应，只是在长链核酸电泳过程中测序，理论上读长可以达到上万个碱基。这些优势使得作为第三代测序技术的纳米孔测序非常具有诱惑力：能在极短时间内（比如数小时）以极低的成本（比如几百美元）完成一个哺乳动物基因组de novo测序（高读长使得拼接方便）。尽管如此，纳米孔测序技术距离实际应用还有相当的距离，很多技术细节都面临着挑战。比如，前面提到DNA通过纳米孔的速度很快，达到s每核苷酸的级别，可是目前传感器的灵敏度远远达不到在这个速度下检测电流变化。只有通过各种方法（比如某种酶）降低DNA的通过速率，达到ms每核苷酸，才能使用已有的检测器。此外，在芯片上大规模集成纳米孔也是技术的难点。为了解决纳米孔测序的一系列技术难题，通过与其它电子技术和生化技术的结合，纳米孔测序出现了几种不同的技术解决方案，但这些方案又都面临着问题。总体来看，有以下四种方案。第一种方案完全是以前述的纳米孔测序原理为基础，通过检测DNA电泳通过纳米孔的电流变化来测序。这种方法的最大挑战是，由于纳米孔总有一定的厚度，往往能同时容下10-15个核苷酸链。因此，对应的特征电流是这么多核苷酸的综合效果，而不能达到一次检测单个碱基的目的。由于纳米孔的电场宽度是由孔径决定的，会向纳米孔两端各延伸一个孔径的距离。根据计算，要能容纳一个核苷酸通过的纳米孔最小孔径是1.5 nm，这意味着纳米孔的厚度最小也要3 nm，还是不能达到单碱基测序的灵敏度。但是，研究证实这种方法可以有效区分通过纳米孔的单链和双链DNA。这就为将纳米孔测序与杂交测序（SBH）结合起来创造了条件。前面已经提到，SBH在de novo测序方面有很大困难，因为不能得到探针在杂交片段上的位置和数量等信息。而将每轮杂交后的片段通过纳米孔，就能得到这些信息，从而实现de novo测序。这就是杂交辅助纳米孔测序的原理（Hybridization assisted nanopore sequencing）第二种方案为了达到单碱基测序的目的，采用了一种酶切检测的方法。在DNA即将通过纳米孔时，用一种连接在纳米孔上的内切酶将末端核苷酸切割下来，随后以单核苷酸的形式通过纳米孔，检测阻断电流特征峰，随后再切割下一个碱基就能实现单碱基测序。这种方法的挑战是找到合适的工作酶，保证切割下的单核苷酸全部依次的进入纳米孔并流出，检测的单核苷酸电流信号能代表DNA的序列，和合适的纳米孔和酶的连接方法。还有另一种方案能解决问题。通过某种方法将DNA上四种核苷