血清生化物质测定步骤.doc

血糖测定方法（邻甲苯胺法）一、原理：葡萄糖为一含醛基的己糖，在酸性与加热情况下脱水反应生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛，再与邻甲苯胺缩合成芳香族第一级胺青色的席弗氏碱。二、试剂：1、邻甲苯胺试剂：取冰醋酸920ml，加入硫脲（Thiourea）1.5g，待其溶解，加邻甲苯胺（o-Toluidine）80ml，充分混合后，取此液960ml加入饱和硼酸溶液40ml，混匀，放置于棕色瓶中。2、饱和硼酸溶液：称取硼酸6g，以蒸馏水溶解并稀释至100ml，放置一夜，过滤即可应用。3、葡萄糖贮存标准液（1ml=5mg）：将少量无水葡萄糖，CP置于硫酸干燥器内一夜。精确称取此葡萄糖500mg，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100ml容量瓶内，以饱和苯甲酸溶液加至刻度。此液可长期保存。4、葡萄糖应用标准液（1ml=0.05mg）：取葡萄糖贮存标准液1ml置于100ml容量瓶内，加入饱和苯甲酸溶液至刻度。5、饱和苯甲酸溶液：称取苯甲酸（Benzoicacid）2.5g，于800ml蒸馏水中，加热溶解，冷却后加蒸馏水至1000ml。三、操作：步骤管别测定管标准管空白管血清（ml）0.1葡萄糖应用标准液（ml）0.1蒸馏水（ml）0.1邻甲苯胺试剂（ml）5.05.05.0放沸水煮沸8min，冷水冷却，用640nm或红色滤光板光电比色，用蒸馏水作空白，记录各读数。计算：（测定-空白）/（标准-空白）*0.1*100/0.1=葡萄糖毫克%血清白蛋白测定（酚试剂法）一、 原理：用硫酸钠将血清中球蛋白沉淀，所分离的白蛋白加酚试剂而呈蓝色，与含酪氨酸的标准管比色，求得白蛋白量。血清总蛋白减去白蛋白即为球蛋白量。白蛋白与球蛋白分离：球蛋白与白蛋白不同，具有易溶于稀盐溶液而不溶于浓盐溶液的特点。故以23%硫酸钠或21%亚硫酸钠溶液沉淀球蛋白。再利用乙醚将白蛋白与球蛋白分离。二、 试剂：1、 酪氨酸标准液（1ml=0.2mg）：精确称取酪氨酸（Tyrosine）0.2g，置于1000ml容量瓶中，用0.1当量盐酸溶液稀释至刻度。2、0.1当量盐酸溶液：取浓度为36.5%，浓度为11.9M的市售浓HCl加水配制成1L:取XL的上述浓盐酸,因为盐酸是1-1价的离子组成的酸,当量浓度等于MOL浓度,据配制前后溶质的MOL数相等,则有如下计算:(X*11.9)/0.1=1,X=0.0084L.将浓盐酸加入到1000ML的容量瓶中,再加水到1L刻度为止即得0.1个当量的盐酸.3、 23%硫酸钠溶液：称取无水硫酸钠230g，加蒸馏水至1000ml。加热溶解，冷却后补足蒸馏水量。4、 酚试剂：钨酸钠（NaWO42H2O）100g 钼酸钠（NaMO42H2O）25g 蒸馏水 700ml 置于2000ml烧瓶内，再加入85%磷酸（H3PO4）50ml，浓盐酸（HCl）100ml。 应用回流冷凝器煮沸10小时（烧瓶内可加入小玻璃珠10数颗，以防煮沸时溶液冲入冷凝管而溢出）。除去冷凝管后，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml，溴液（或30%过氧化氢）数滴，继续煮沸15分钟，以除去多余的溴（或过氧化氢）。因溴刺激性大，应在排气柜内进行。制成的酚试剂为鲜明黄色，保存于棕色瓶内备用。5、10%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠100g，加100ml蒸馏水至1000ml。三、操作：步骤如下：（1）取边缘完整的试管一支，加入血清0.2ml；（2）加入23%硫酸钠溶液3.8ml，混匀；（3）吸取1ml于另一试管内，作为总蛋白管；（4）在原管内加入乙醚不少于2ml，堵住管口用力振荡10余次；（5）放置在37水温箱内，不少于10min，2500转离心沉淀5min，此时试管内分成三层：上层为乙醚，中层为球蛋白，下层为澄清的白蛋白溶液；（6）斜执试管，使中层的球蛋白能与管壁分离，用1ml吸管沿管壁通过球蛋白的空隙处插入管底，小心吸取清晰的白蛋白液至1ml；（小心，准确，且不可触及球蛋白块片）。（7）拭去吸管外壁的液体和球蛋白，然后移于另一试管内，作为白蛋白管。（8）取试管3支，按表操作步骤管别总蛋白白蛋白管标准管空白管总蛋白悬液（ml）1白蛋白悬液（ml）1酪氨酸标准液（ml）123%硫酸钠溶液（ml）110%氢氧化钠溶液（ml）4444酚试剂（ml）1111蒸馏水（ml）2222混匀后，静置10min，用520nm或绿色滤光板光电比色，以蒸馏水校正光密度到0点，记录读数。计算：总蛋白：（测定-空白）/（标准-空白）*0.2*100/0.05*16/1000=白蛋白克%白蛋白：（测定-空白）/（标准-空白）*0.2*100/0.05*16.6/1000=白蛋白克%乳酸测定方法原理 在铜离子催化下，乳酸与浓硫酸在沸水中反应，乳酸转化为乙醛，乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物，在波长560nm处有强烈的光吸收，故可进行定量测定。2仪器与试剂2.1仪器：微量吸管，恒温水浴锅，电热水箱，分光光度计。2.2试剂：4%CuSO4，浓硫酸(AR)，1%NaF溶液蛋白沉淀剂：按体积分别取一份10%的钨酸钠，一份1/3 mo1/L硫酸，再与28份蒸馏水混合即成；沉淀剂NaF混合液：按体积分别取3份沉淀剂，1份1% NaF混合即成；1.5%对羟基联苯溶液：称取1.5g对羟基联苯（白色）定溶于100mL热的0.5% NaOH中(可保存半年)；乳酸标准储备液(1mg/mL)：称取106.6mg乳酸锂或171mg乳酸钙，以10%的三氯乙酸定容至100mL(室温下可保存半年)；乳酸标准应用液(0.01mg/mL)：准确吸取1.0mL乳酸标准储备液稀释定容至100mL，此液要求现用现配。测定步骤：于5mL试管中加入0.48mL 1%NaF溶液，准确吸取血201加入试管底部。用试管上部清液清洗微量吸管数次，再加入1.5mL蛋白沉淀剂，振荡混匀，于3000r/min离心10min，取上清液，按下表操作。空白管（mL）标准管（mL）测定管（mL）沉淀剂NaF混合液0.5乳酸标准应用液0.5上清液0.54%CuSO40.10.10.1浓硫酸333充分混匀,置沸水浴加热5min取出后放入冰水浴冷却10min1.5%对羟基联苯0.10.10.1上述步骤完成后，摇匀，置30水浴30min(每隔10min振摇一次)。取出后放入沸水浴中加热90S，取出冷却至室温，在波长560nm处用5mm光径比色皿比色，空白管调零。3.1血乳酸含量计算血红蛋白测定步骤（1）用血红蛋白吸管准确吸取血液20uL，伸入预先盛有4ml 0.1mol/LNaOH的5ml试管底部，轻轻挤出，反复吸洗数次，碱化10min。（2）于96孔酶标板上设置空白、标准品、测定孔，每孔分别加0.1mol/L NaOH 20 uL，取碱化后标准品及标本各10 uL，加入酶标板中，轻轻震荡，充分混匀，室温放置10min后用酶标板比色，波长520nm处比色。加样步骤：0.1mol/L NaOH标准品样本蒸馏水空白孔100uL-100uL标准孔100uL100uL-测定孔100uL-100uL-测定血红蛋白所需物品：血红蛋白吸管、5ml试管、100 uL枪头、96孔酶标板。红细胞测定步骤（1）用血红蛋白吸管取血液20uL，加入到盛有4ml 0.9%NaCl溶液的5ml离心管中，轻轻挤出血液并反复吸洗23次，然后将血液与稀释液混合均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。（2）立即用毛细吸管吸取红细胞稀释血液，滴入已准备好的洁净细胞计数室内，放置片刻，待红细胞下沉。（3）用低倍镜计数细胞计数室中央大方格四角的四个中方格和中央的一个中方格（共5个方格）内的红细胞总数，计数原则：划线上的血细胞，数上不数下，数左不数右。红细胞数/mm3=5个中格红细胞数*稀释倍数（200倍）/计数的5个中格容积（0.02 mm3）白细胞测定步骤（1）用血红蛋白吸管取血液20uL，加入到盛有0.38ml 白细胞稀释液的5ml离心管中，轻轻挤出血液并反复吸洗23次，然后将血液与稀释液混合均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。（2）立即用毛细吸管吸取白细胞稀释血液，滴入已准备好的洁净细胞计数室内，放置片刻，待白细胞下沉。（3）用低倍镜计数细胞计数室四角的四个大方格内的白细胞总数，计数原则：划线上的血细胞，数上不数下，数左不数右。白细胞数/mm3=4个大方格白细胞数*稀释倍数（20倍）/计数的4个大方格容积（0.4 mm3）血清离心步骤取盛有血液的小试管在4条件下静置2h后以5000r/min离心15min，再静置待其分层后吸取上层血清于-20下保存待测。准备：每尾鱼需以下物品：1ml注射器一支、抗凝剂试管1个、红细胞稀释试管1个、白细胞稀释试管1个、血红蛋白试管1个、酶标板一块血清谷丙转氨酶（GPT）测定方法1、 原理：作用于丙氨酸及-酮戊二酸组成的基质，产生丙氨酸和谷氨酸。丙氨酸与2，4-二硝基苯肼相作用，形成丙氨酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显红棕色。2、 试剂：1、M/15磷酸盐缓冲液（Ph7.45）：将M/15磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液82ml及M/15磷酸氢二钾（KH2PO4）溶液18ml，混合，贮存冰箱内备用。2、丙酮酸钠标准液（1毫升=2微克分子）：准确称取已在干燥器内干燥至恒重的丙酮酸钠11mg，置于50ml容量瓶内，加磷酸盐缓冲液稀释至刻度（此液不能久置，每次制作标准曲线时，宜当日新鲜配制）。3、谷丙转氨酶基质液配制：称取分析纯-酮戊二酸30mg，DL-丙氨酸（dl-Alanine）1.78g。 将上述两项基质分别置于100ml容量瓶内，加入磷酸盐缓冲液（Ph7.45）约50ml，先行溶解，加入当量氢氧化钠0.5ml使全部溶解，校正Ph至7.45，最后以磷酸盐缓冲液稀释至刻度，分装于清洁小型旋口试剂瓶内（每瓶只能装瓶容量的三分之二，以免因冰冻导致瓶破裂），保存于冰盒内，使用时置37水温箱内使全部溶解，混匀后方可应用。 4、2，4-二硝基苯肼溶液：称取分析纯2，4-二硝基苯肼20mg，置于100ml容量瓶内，加入蒸馏水约50ml及浓盐酸10ml，使全部溶解，最后以蒸馏水稀释至100ml。 5、0.4当量氢氧化钠溶液。3、操作：步骤丙氨酸转氨酶测定管对照管血清（ml）0.10.1基质液（ml）0.5混合，放置37水温箱60分钟，对照管则不放水温箱2,4-二硝基苯肼溶液（ml）0.50.5基质液（ml）0.5混合，放置37水温箱20分钟0.4当量氢氧化钠溶液（ml）5.05.0混合后，放置10分钟，用520nm绿光板进行光电比色，记录各管光密度，测定管减去对照管查标准曲线。标准曲线的绘制步骤管别123456丙酮酸钠标准液（ml）00.050.100.150.200.25谷丙转氨酶基质液（ml）0.50.450.400.350.300.2