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自体干细胞移植治疗下肢缺血的规范化方案2013-09-26 11:10阅读：193来源：生物谷责任编辑：陈文章导读下肢缺血是一种常见疾病，具有发病率高，致残率高和治愈率低的特点。在我国造成下肢缺血的主要病因是动脉粥样硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病足等。谷涌泉、黄平平、杨晓凤等利用自体骨髓干细胞移植，自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血疾病，临床研究结 下肢缺血是一种常见疾病，具有发病率高，致残率高和治愈率低的特点。在我国造成下肢缺血的主要病因是动脉粥样硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病足等。谷涌泉、黄平平、杨晓凤等利用自体骨髓干细胞移植，自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血疾病，临床研究结果证明安全有效。 结合众位专家治疗的方案，中华医学会医学工程学会干细胞工程专业委员会组织编写的自体干细胞移植治疗下肢缺血的专家共识。该共识对于开展干细胞临床规范有着重要的指导意义。 干细胞移植治疗下肢缺血疾病的主要目标是“促进下肢血管新生” 下肢缺血是一种常见疾病，具有发病率高，致残率高和治愈率低的特点。在我国造成下肢缺血的主要病因是动脉粥样硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病足等。临床表现主要为早期的间歇性跛行，中期的静息痛和晚期的组织缺损，后者包括溃疡和坏疽。 一般来讲，通过下肢动脉旁路移植或下肢动脉介入治疗可以达到增加行走的距离，缓解疼痛，或者促进溃疡的愈合等的目的。然而，对于部分患者，由于下肢远端动脉流出道不良，动脉旁路移植和介入治疗无法完成，或者效果不良，就面临着截肢的危险，甚至危及生命。 尤其是糖尿病下肢缺血和血栓闭塞性脉管炎患者，病变多累及下肢远端小动脉，在过去这部分病人就难以避免截肢。而自体干细胞移植作为血管再生的新技术，正好为他们提供了一种新的救肢方法。 干细胞移植治疗下肢缺血的主要目标是促进下肢血管新生。而其中起主要作用是造血干细胞。正常情况造血干细胞主要存在于骨髓中，外周血液循环中很少。而通过骨髓动员刺激后造血干细胞可以被动员到外周血液循环中，因此目前临床上常用的三种不同来源的自体干细胞方式治疗下肢缺血，即单纯骨髓来源的自体干细胞移植、外周血来源的干细胞移植和骨髓动员后的骨髓来源的干细胞移植。 选择自体干细胞移植治疗下肢缺血疾病优点众多，具有广阔的前景 自体干细胞移植至少有以下几个优点：1、不存在异体干细胞的免疫排斥；2、没有胚胎干细胞的伦理道德问题；3、作为患者本人的细胞，仅仅是采用富集提纯的办法，没有在体外进行诱导分化和增殖，也不存在基因突变的风险；4、在严格无菌下操作，体外分离时间短（2个小时左右），微生物污染的可能性小；5、正如患者本身的植皮一样，都是患者本身的组织，具有取材方便的特点。因此，目前自体干细胞移植治疗疾病呈现出广阔的前景。 根据干细胞的来源不同，自体干细胞移植一般分为骨髓的干细胞和外周血的干细胞移植和改良的骨髓干细胞移植。 1.自体骨髓干细胞移植 目前研究认为，骨髓单个核细胞中的CD34阳性细胞是EPC的主要来源，CD34（CD34为造血干细胞及内皮细胞表面标记物）细胞，在末梢血中只有骨髓的0.2%.可测定的最幼稚细胞在1ml末梢血中仅有2.9个，为骨髓的1%. 这就提示，骨髓细胞有可能提供更多的EPC用于血管新生疗法。骨髓单个核细胞（BM-MNC）移植是由EPC移植衍生出来的一种血管新生疗法。成年个体的BM-MNC中含有多种干细胞成分，其中EPC含量约占BM-MNC总数的3%,为外周血的15倍，同时BM-MNC移植还可以提供多种促血管生长因子，故BM-MNC移植兼具EPC和细胞生长因子的作用。 故应用自体骨髓细胞移植的优点可归纳为：（1）包括EPC,能够参与缺血病变中的血管形成；（2）能产生诱发血管生成的一些生长因子和细胞因子；（3）不会发生异体骨髓移植的移植物宿主疾病；（4）分离EPC 花费高昂，耗时费力，且分离EPC的同时也去除了可能促进血管生成的细胞和细胞因子。故目前治疗下肢缺血时多采用含有EPC的单个核细胞进行移植。 Shintani等将兔的自体骨髓单个核细胞注入缺血下肢的腓肠肌，2周后发现移植的骨髓单个核细胞存在于骨骼肌的新生内皮细胞毛细血管网，毛细血管密度较对照组增加， 提示自体骨髓单个核细胞局部移植增加缺血下肢的新生血管形成和侧支血管形，取得了较好的临床疗效。 Tateishi等首次报道应用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病， 开创了血管新生在临床应用的先例； 谷涌泉等首先在国内应用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病并取得了成功。目前已经治疗了500余例患者，取得了令人兴奋的疗效。 谷涌泉等不仅采用了国外的方法，即下肢肌肉局部注射；而且还在国际上率先采用了经下肢动脉导管注射的新方法，并对这2种不同自体骨髓干细胞移植的方法治疗严重下肢缺血性疾病进行了对比，发现这2种方法的疗效在统计学上没有明显差异。 2.自体外周血干细胞移植 正常生理状况下，“定居”骨髓的绝大多数骨髓干细胞（99.15 %） 处于休眠状态（G0 期） , 仅0.65 %的骨髓干细胞在血液中“游行”和“巡逻”.当某些组织中的细胞因衰老等原因死亡时， 此部位会产生一“位置缺陷”信号， 此信号的产生不仅来自细胞死亡后留下的位置空缺信号且细胞破裂后释放的胞内细胞因子及蛋白分子， 也可产生此部位局部浓度梯度的改变。 这些因变化而产生的信号将使骨髓干细胞被“征募”到循环中参与远处多种组织的再生。但这种“自发”的“征募”作用较弱， 人们想到用骨髓干细胞动员剂将骨髓干细胞“驱赶”到外周血中， 从而使外周血干细胞达到治疗数量， 利用干细胞“自发”的向损伤组织“归巢”, 并在特定的组织微环境作用下分化为受损组织细胞的特性， 达到修复缺血损伤的作用。 利用骨髓和外周血干细胞池之间的动态平衡，动员骨髓干细胞促进其进入外周血以供采集、移植，从而使自体外周血干细胞移植成为一种治疗缺血性疾病有效的途径之一。 中国医学科学院天津血液病研究所黄平平等在采用外周血干细胞治疗白血病的基础上，采用类似的技术手段，在国际上最早开展了自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血并取得了成功。他们研究的临床效果很令人鼓舞。谷涌泉等和沈阳空军第463医院也相继开展此技术。 自体外周血单个核细胞移植治疗下肢缺血性疾病也是一种简单、安全、有效的方法；然而由于骨髓动员期间，外周血液循环中单个核细胞的量增加明显，外周血的粘稠度明显增加，血管内血栓形成的机会大大增加，从而增加心肌梗死或/脑梗塞发生的危险。因此，在骨髓动员早期就应采用正规的抗凝措施，在整个过程中需要注意心脑血管并发症的发生。 3.改良的骨髓干细胞移植 在单纯骨髓干细胞移植中，骨髓血的抽取量一般在400500ml,得到的骨髓单个核细胞总数在13 x109个。由于病人大多年龄比较大，体弱并多伴有其它疾病，如冠状动脉硬化性心脏病或/和脑动脉硬化症等，如果一次抽取过多的骨髓血，势必造成其它并发症。一种新的方法，就是骨髓动员刺激以后的骨髓干细胞移植，称之为“改良的骨髓干细胞移植”. 主要步骤是在抽取骨髓前使用粒细胞集落刺激因子（GSF）刺激骨髓2-3天，每天300ug;然后抽取骨髓血110-200ml,在干细胞实验室分离纯化后再进行移植。从临床研究的资料中发现：无论是主观评价指标，或是客观评价指标均比单纯的骨髓干细胞移植和外周血干细胞移植的疗效明显提高；而且不良反应也较外周血干细胞为少。 与前2种方式相比较，此方式的主要优点是：（1）抽取骨髓血量少于200ml,对患者全身影响不大；（2）动员时间不长，外周血液中单个核细胞的数量不高，血液粘稠度比外周血干细胞低，发生心脑血管意外的几率较小。 自体干细胞移植治疗下肢缺血疾病临床路径及实施方案 一、技术的准入 尽管是自体干细胞移植，没有异体干细胞的免疫排斥，也不存在胚胎干细胞的伦理道德问题，但是专家们认为：一般需要医院的医学伦理委员会和新技术委员会的批准。 二、病人的选择（适应症与禁忌症） （一）适应症： 1、各种原因导致的慢性下肢缺血性疾病影像学检查病变远端没有动脉流出道，无法行手术搭桥或者介入治疗，而保守治疗无效者； 2、尽管有较好流出道动脉，有动脉旁路移植或者介入成功可能，但是对于年老体弱，无法耐受手术和介入等创伤打击的患者。 （二）禁忌症： 并不是所有的糖尿病下肢缺血的患者都适合进行干细胞移植。目前在临床上有以下几种情况属于排除的对象： 1、控制不好的糖尿病病人；2、过去5年内明确有恶性疾病的患者或血中肿瘤标记物（AFP,CEA,PSA,CA19-9,CA125）水平明显升高者；3、严重心、肝、肾、肺功能衰竭或一般状况很差不能耐受干细胞移植手术者；4、近期有心肌梗死或脑梗塞病史者禁忌，而有冠心病、脑缺血病史者也要慎用；5、目前仍在吸烟又不准备戒烟者；6、主动脉、髂动脉等大动脉闭塞者。 三、干细胞移植的围手术期处理 四、病人的准备 1、思想准备 不少患者经常在术前紧张，不清楚干细胞是何种新技术？这时我们一定要比较详细地向患者说明干细胞的优点和不足之处，使患者有比较充分的准备。特别要说明干细胞的微创性，使患者消除顾虑，轻装上阵。 2、身体准备 在移植部位要备皮等处理，需要血管腔内介入方法的患者，术前可以先行碘过敏试验，合理抗生素选用，并行过敏试验等。 手术当天要禁食水，静脉输液保证患者的基本的需求量和营养。如果术前血色素低 于10g,建议备血200ml,在穿刺骨髓，抽取骨髓血之前缓慢输血。 五、实验室的处理（干细胞制备） 六、干细胞移植的方法、步骤和措施 一般由2种方法可以移植，分别为：缺血肢体的局部注射移植和下肢动脉腔内注射移 植。医生可根据患者的身体情况和病变情况选择适合患者的方法进行移植。 （一）局部缺血肌肉注射： 1、麻醉可选用硬膜外或者腰麻，也可选择静脉复合麻醉。由于注射范围广，次数多，局部麻醉不推荐。麻醉成功后，可以消毒、铺巾。也可以先消毒、铺巾后再麻醉。 2、抽取20-50ml的生理盐水稀释制备好的干细胞悬浊液，然后抽取上述稀释后的干细 胞悬浊液备用。 3、在注射部位划出要注射的具体位置。一般针距2ml左右。每针注射1ml. 注射后用酒精纱布消毒皮肤后包扎。 （二）下肢动脉腔内注射 1、一般选用局部麻醉。先消毒、铺巾后，用1%利多卡因行股动脉区域的局部麻醉，成功后穿刺同侧股动脉或者对侧股动脉，放置5F动脉鞘管后备用。 2、用导丝和导管缓慢选择到下肢动脉，交换导丝后，送入球囊到病变部位，充盈球囊，阻断动脉后将干细胞悬浊液缓慢推入动脉腔内。3-5分钟完成，放松球囊并撤除。 3、退出动脉鞘管，压迫穿刺口15-20分钟后包扎穿刺口。 七、干细胞移植术后的处理 1、术后处理一般要采用抗生素3天。 2、对于局部注射患者，术后2-3天后换药，撤除包扎的纱布，患者恢复到正常状态。 3、对于动脉腔内注射患者：一般术后患者要卧床24小时，下肢制动6小时。术后要用低分子肝素预防卧床造成的血栓形成。 4、对于糖尿病足患者术后要常规应用低分子肝素，这对于微血栓的治疗有一定作用。 5、术后也可以采用血管扩张药物。 八、干细胞移植术后评价 （一）安全性评价 干细胞移植的安全性问题不容回避。对干细胞移植安全性的忧虑主要是免疫排斥和肿瘤生长的问题。采用自体干细胞移植将不存在免疫排斥的问题；但由于干细胞是未分化细胞，移植的干细胞是否会在移植部位分化为其他组织如骨组织或出现肿瘤样生长？我们的病人中有一些患者移植后未能避免截肢，对30余例截肢标本的病理学检查，并未发现移植部位有成骨现象和肿瘤征象；500多例未观察到严重不良反应。而且我们的病例中有相当一部分随访时间超过了5年（11），可以说明本技术方法是安全的。因此，对于安全性的评价，必须注意下面几点： 1、是否有致瘤性？2、有无局部的不良反应？包括局部有无红、肿、热、痛等炎症反应及过敏反应？3、有无全身的不良反应？4、术后肝肾等功能的变化？（二）有效性评价 临床观察有效性的主要指标和方法主要包括主观指标和客观指标。其中主观标包括以下几点：疼痛、冷感、麻木等主观症状的改善程度。而尽管是主观指标，也要尽量地客观化。我们采用一个分数标准来评价这些主管指标。 1、疼痛：疼痛评分标准：0分：无疼痛；1分：偶有疼痛，被问及能回忆起；2分：疼痛经常出现但能耐受，不需或偶用一般止痛剂；3分：经常用一般止痛剂；4分：因疼痛影响睡眠，一般止痛药剂难以缓解。 治疗前：（）分；治疗后：（）分。 2、冷感评分：0分：无冷感；1分：患者偶述受累肢体有发凉、怕冷的感觉；2分：受 累肢体经常有发凉、怕冷的感觉；3分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，需要采用局部保温措施，症状能得到一定程度的缓解；4分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，采用局部保温措施，症状也无明显改善。治疗前：（）分；治疗后：（）分。 3、麻木的评分标准：0分：无麻木；1分：偶感轻度麻木；2分：经常有轻度麻木不适3分：麻木感觉明显，但可以忍受；4分：麻木非常明显，难以忍受，严重影响日常生活。 客观评价标准主要包括： （1）间歇跛行的距离：干细胞移植前后跛行距离的变化。主要测定无痛步行时间（分）或跛行距离（米），此项指标带有一定的主观性，但是如果使用平板实验，则是一种非常简单和客观的指标。 （2）皮肤的温度差（双下肢）：移植前后的变化。 （3）经皮氧分压（TCPO2）：作为全球通用的三大评估血管疾病金标准之一，直接反映血管向组织供氧情况，可以对肢体缺血情况的定量评估， 可以评估组织存活率；是一种无创，低成本并可重复使用的检查方法；经皮氧分压测定，是一种比较客观的指标，国外经常用此项检查作为截肢与否和预测截肢平面，一般临床上以20mmHg作为临界值，不过受周围环境影响较大，因此检查前患者一定静息平卧30分钟以上，检查室内温度要保持恒温。 （4）患肢紫绀及溃疡的面积和深度（mm），坏疽范围测量并标记，作为客观的评价指标之一，能够证明干细胞移植后是否有效；不过，即使血供得到了改善，溃疡面的愈合仍需要一定的时间，尤其是较大溃疡者，一般近期疗效中仅适用于小溃疡者。 （5）测定静息状态下踝肱指数（ABI）；是一种简单、方便和有效的客观评价指标，但是不少患者在短期内不会增加得很明显。 （6）激光多普勒血流量的测定：作为一种评价下肢血供的金标准之一，具有灵敏度高，操作简单的优点，是一种非常好的无创检查的评价指标。 （7）动脉造影（DSA）：观察侧支血管形成情况并评分。根据新生侧支血管评估分4级：0（无新生侧支血管）、+1（少许新生侧支血管）、+2（中量新生侧支血管）和+3（丰富新生侧支血管）。 （8）截肢平面的变化：由于血管性截肢与血液供应具有相关性，截肢平面经常受到血液供应的影响。如果移植前后的截肢平面有一定的变化，能够达到降低截肢平面的目的，也能够说明干细胞移植的有效性。 九、干细胞移植术后不良反应的处理。 尽管干细胞移植是一种比较安全的方