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第9章色谱法概论 Chromatography 色谱法 chromatography 也称之为色层法或层析法 是一种物理或物理化学分离分析方法 目前在生命科学的研究 临床诊断 病理研究 法医鉴定 药物的研究开发 质量控制等领域被广泛应用 第1节色谱法的起源 历程及分类 一 色谱法的起源 俄国的植物学家茨维特 M Tswett 于1903年首次提出色谱法 1903年3月21日茨维特Tswett 1872 1919 在华沙自然科学学会生物学会议上发表了 一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用 研究论文 介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法 Tswett把分离后由不同颜色构成的色带叫做 色谱 二 色谱法的历程 在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明 直到1931年德国的Kuhn和Lederer才重复了Tswett的某些实验 用氧化铝和碳酸钙分离了 和 胡萝卜素 此后用这种方法分离了60多种这类色素 Martin和Synge在1940年提出液液分配色谱法 即固定相是吸附在硅胶上的水 流动相是某种有机溶剂 色谱法就是根据组分在流动相和固定相中分配行为的不同进行分离和分析的方法 1941年Martin和Syngee提出用气体代替液体作流动相的可能性 11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱法 因而获得了1952年的诺贝尔化学奖 在此基础上 1957年Golay开创了毛细管柱气相色谱法 1956年VanDeemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论 1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论 为色谱的发展奠定了理论基础 1944年Consden等就发展了纸色谱 1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法 TLC 得以实际应用 而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后 才使TLC得到广泛地应用 在60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱 出现了高效液相色谱 HPLC 而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳 CE 在90年代得到广泛的发展和应用 同时集HPLC和CE优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视 我国在色谱分析领域的研究起于1954年 由中国科学院大连化学物理研究所首先开发 经过几十年的努力 我国色谱基础理论研究和应用技术研究方面具有特色 居世界先进行列 三 色谱法分类 按流动相和固定相的状态分类 流动相固定相液体液体液体固体气体液体气体固体 液 液色谱液 固色谱气 液色谱气 固色谱 液相色谱 气相色谱 2 按分离机理分类 键合相色谱法 bondedphasechromatography 毛细管电泳法 capillaryelectrophoresis 毛细管电色谱法 capillaryelectro chromatography 吸附色谱法 adsorptionchromatography 分配色谱法 partitionchromatography 空间排阻色谱法 stericexclusionchromatography 离子交换色谱法 ionexchangechromatography 3 按操作形式分类 柱色谱法 经典的液相柱色谱法 气相色谱法 高效液相色谱 平面色谱法 薄层色谱法 纸色谱法 4 按使用目的分类 分析用色谱 制备用色谱 流程色谱 分离效率高分析速度快检测灵敏度高 四 色谱法的特点 样品用量少选择性好 应用范围广 定性能力较差 第2节色谱过程与术语 一 色谱过程 色谱过程是物质分子在相对运动的两相间分配 平衡 的过程 混合物中 若两个组分的分配系数不等 则产生差速迁移 最终被分离 二 色谱图与色谱峰 由检测信号强度对时间作图所绘制的曲线称为色谱流出曲线 又称为色谱图 流出曲线上的突起部分称为色谱峰 正常色谱峰为对称形正态分布曲线 一个组分的色谱峰可用三项参数说明 峰高或峰面积 用于定量 峰位 用于定性 峰宽 用于衡量柱效 根据色谱图中色谱峰的个数 可以判断试样中所含组分的最少个数 三 常用术语 1 基线 在操作条件下 没有组分流出时的响应信号 稳定的基线应是一条平行于横轴的直线 基线反映仪器的噪音随时间的变化 稳定性 2 峰高 色谱峰最高点与基线之间的距离 3 色谱峰区域宽度 1 标准偏差 0 607倍峰高处 拐点 色谱峰宽度的一半 2 半峰宽 即峰高一半处对应的宽度 3 峰宽w通过色谱峰两侧的拐点作切线 在基线上的截距称为峰宽 W 4 W 1 699W1 2W1 2 2 355 4 拖尾因子 对称因子 正常峰 对称 前沿峰拖尾峰 T在0 95 1 05之间 T小于0 95 T大于1 05 非正常峰 非正常峰 非正常峰 5 保留值 1 死时间 不被固定相滞留的组分 如空气 甲烷 从进样开始到出现峰极大值所需的时间 就是该组分在流动相中的停留时间 各组分在流动相中的停留时间都是相等的 均为死时间 tR是组分在固定相与在流动相中的停留时间之和 2 保留时间tR从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔 3 调整保留时间tR 组分在固定相中的停留时间 4 死体积VM 由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间称为死体积 5 保留体积VR 从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积 6 调整保留体积VR 某组份的保留体积扣除死体积后 称该组份的调整保留体积 即 7 相对保留值 i s 某组份i的调整保留值与基准物质S的调整保留值之比 称为相对保留值 也是它们的分配系数K 容量因子k之比 相对保留值只与柱温 流动相及固定相的性质有关 而与柱径 柱长 填充情况及流动相流速 流量无关 是色谱定性分析的重要参数之一 6 选择性因子 分离因子 混合物中组分2与组分1的调整保留时间之比 总是大于1 用于衡量色谱柱的选择性 越大 色谱柱的选择性越好 7 分配系数和分配比 1 分配系数K它是指在一定温度和压力下 组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值 即 分配系数是由组分 固定相和流动相的热力学性质决定的 在一定条件下 组分在流动相中溶解度越小 在固定相中溶解度大 则K越大 2 分配比k 分配比又称容量因子 它是指在一定温度和压力下 组分在两相间分配达平衡时 分配在固定相和流动相中的质量比 即 k越大 表示组分分配在色谱柱内固定相中的量越大 相当于柱容量越大 因此 分配比又称为容量因子 容量因子与分配系数的关系如下 k是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数 它不仅与分配系数有关 而且还与流动相及固定相的体积有关 四 色谱过程方程 上式称为色谱过程方程 说明了保留时间与分配系数和容量因子两个重要参数的关系 在一定条件下 容量因子 或分配系数 越大 组分的保留时间也越长 组分A