解脲支原体(UU)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒.docx

解脲支原体(UU)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒 深圳匹基生物工程有限公司开发的解脲支原体(UU)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂 盒具有以下特征：1. 高灵敏度：荧光PCR方法由于其光敏感特性，灵敏度显著高于传统的PCR电泳方法。2. 高特异性：对沙眼衣原体、淋球菌、人乳头瘤病毒等的检测均保持良好的阴性结果。 3. 防污染：与电泳法等不同，该试剂盒无须PCR后处理，完全闭管扩增和检测，同时采用了dUTP-UNG系统，有效地防范了PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，提高临床诊断依据的可靠性。4. 操作简单、耗时短：试剂盒在特定的荧光PCR检测仪上进行扩增和检测，不需要进行电泳或杂交的操作，只需0.5-1.5小时(针对不同机型)即可完成PCR过程，有利于提高报告出具的速度。5. 使用方便：镜检、培养等方法检测UU、NG和CT时均需采集三份样本分别进行，由于采集部位的特殊通常给病人带来极大的痛苦，该试剂盒只需一次采样，同时对检验人员而言，只需处理一次标本，为患者和医生都提供了方便。6. 结果客观可靠：无需人为判断，仪器自动收集和分析数据。 适用机型：Roche LightCycler；BIO-RAD icycler；PE7700；PE5700；ABI7300/7500；LineGene；Rotor-gene等 解脲支原体（M.urealyticum）为脲原体属中唯一的一个种，因生长需要尿素而得名。菌落微小，直径仅有1525um，须在低倍显微镜下观察，故旧称T株 (tiny strain)。菌落表面有粗糙颗粒，在合适条件下可转成典型的荷包蛋样菌落。生长需要胆固醇和尿素，分解尿素为其代谢特征，产生氨氮，使培养基pH上升。 解脲支原体是存在于人类泌尿生殖道的一种重要的病原体，主要通过性生活传播，多见于年轻性旺盛时期，尤多见于不洁性交后。当泌尿生殖道发生炎症，粘膜表面受损时解脲支原体易从破损口侵入，可引起泌尿生殖道感染，临床常见症状为非淋性尿道炎、盆腔炎、前列腺炎、阴道炎、不育不孕症等，也有少数无症状携带者，由于80%孕妇的生殖道内带有解脲支原体，因此可通过胎盘感染胎儿而导致早产、死胎，或在分娩时感染新生儿，引起呼吸道感染；此外，解脲支原体还可引起不孕症，解脲支原体是近年来越来越引起临床重视的病原体之一，并被认为是非淋球菌性尿道炎中仅次于衣原体（占50%）的重要病原体。诊断解脲支原体感染常用的实验室方法有以下几种：(一) 分离培养方法 UU在含95% 氮气和5%CO2 环境中生长良好。其生长最适pH为5.5-6.5,最适温度为36-37。UU具有尿素酶，能分解尿素产氨，使含酚红指示剂的UU液体培养基pH值上升，颜色由黄色变为红色。再将液体培养物转种到UU固体培养基上，能生长成具特征性油煎蛋样集落。 (1 )液体培养基：支原体肉汤培养基80mL，马血清或小牛血清10mL，酵母浸液10mL, 10 %尿素溶液0.5mL-1.5mL, 0.4%酚红溶液0.5mL,青霉素(使其在培养基中的浓度为500U/mL-2000U/mL,)用1N HCl 调pH值至5.5-6.5, 用小试管分装后置冰箱中备用，每管1.5-2.0mL。 (2 ) 固体培养基：在100mL 支原体肉汤培养基中，加入琼脂1.2-1.4g, ,高压灭菌后冷却到 50 左右，逐一加入上述添加剂。摇匀，倒入无菌平皿中，待凝固后，置冰箱中备用。 接种标本后，经孵育，若培养基发生由黄变红的颜色变化，透明无混浊(有别于某些细菌及真菌生长)则可初步判断为有支原体生长。大多数UU在24h内可获得阳性结果。如果培养基发生颜色变化，但液体又有混浊，则应排除杂菌污染, 可用0.45m滤膜过滤后，作再接种观察。进一步诊断需将液体培养物接种到固体培养基上培养, 经Dienes法染色后在低倍显微镜下观察集落形态。阴性结果最好观察天。UU在固体培养基上集落核心呈粗颗粒状,具极窄的边，有时呈油煎蛋样。如用 Dienes 法染色，集落为特异的蓝色。一般细菌的菌落不着色，容易鉴别。 (二) 代谢抑制试验根据特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢这一特性，可用病人血清进行代谢抑制试验。在加有抗血清的培养基中，支原体的代谢受到抑制，从而阻止了培养基的颜色改变。代谢抑制试验也可用于检测感染支原体患者血清抗体的滴度。即将血清作10倍连续稀释后，滴入支原体培养液，并以不加血清的支原体试验管和不加支原体液的培养基管作对照。经37培养，不加抗血清的培养管支原体应生长良好，培养基变成红色(Uu或Mh)，未加支原体液培养基管颜色不变。未发生颜色变化的最高血清稀释度为代谢抑制试验的抗体滴度。 (三) 间接血凝试验在一定条件下，抗体和相应抗原相遇，可形成抗原抗体复合物。这种复合物分子团很小,不能形成肉眼可见的反应。用经鞣酸处理的红细胞作载体，将抗原吸附在其表面，使红细胞致敏，待与相应的血清抗体相遇时，可出现肉眼可见的凝集现象。 (四) 生长抑制试验特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢。用直径为6mm-8mm的圆形灭菌滤纸片，以未稀释抗血清浸透后放入无菌平皿内，于下干燥后待用。 吸取待检菌液0.5mL涂布于固体培养基上，置7使琼脂表面稍干燥。以无菌操作镊取抗血清纸片放于琼脂表面,培养4日-5日后,在低倍显微镜下观察滤纸片周围有无支原体生长。若滤纸片周围无菌落生长，出现抑菌圈大于2mm者表示该支原体与抗血清系同种免疫原，小于2mm判为异种。 (五) 分子生物学诊断方法目前主要应用荧光定量PCR法。具有高度特异性和敏感性、且快速、简便。 荧光PCR对UU的检出意义 PCR是以通过大量特异性扩增靶DNA或RNA序列为手段从而达到临床诊断目的的检测技术，具有快速、灵敏、特异、简便的优点，可以直接检测临床样本中极微量的病原体。它与传统的诊断方法相比，在灵敏性和特异性上有了很大的提高，时间也大大缩短。而近年发展的荧光PCR技术在原PCR的基础上，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测，避免了PCR后处理，灵敏度和特异性均得到显著的提高。目前对解尿支原体实验室的传统检验方法均存在灵敏度和特异性不高或过于费时、昂贵等缺点，荧光PCR方法的出现为解尿支原体的检测提供了一种非常行之有效的检测手段。采用荧光PCR法检测解尿支原体有许多优越性： 1）有利于早期诊断。对于患者，可以说解尿支原体初感染时几乎见不到特异症状，但正是这个原因，延误了治疗。解脲支原体可侵犯尿道、宫颈及前庭大腺，引起尿道炎、宫颈炎与前庭大腺炎，上行感染时，可引起子宫内膜炎、盆腔炎、输卵管炎，尤其输卵管炎多见。解脲支原体感染造成的女性生殖器官病理性改变，是不孕不育的重要原因。国内外资料提示，不孕症夫妇的宫颈粘液中解脲支原体培养阳性率高达50%以上，由此可见，解脲支原体感染与不孕症的发生有相关关系。解脲支原体感染造成不良的另一个结果是流产，有人从流产的组织中检查出解脲支原体的阳性率高达40%以上。因此，对不明原因的流产，尤其是多次流产者，应考虑有解脲支原体感染的可能。解脲支原体感染造成的不完全梗阻的输卵管炎性粘连，可使管腔狭窄，通而不畅，还是发生宫外孕的重要原因。妇女妊娠后，由于孕激素的增加，抑制了细胞免疫，机体抵抗力下降，更易受到解脲支原体的感染，解脲支原体引起的围产期感染已是现代产科面临的新问题。解脲支原体可以经胎盘垂直传播或由孕妇下生殖道感染上行扩散，引起宫内感染，两者均可导致流产、早产、胎儿宫内发育迟缓、低体重儿、胎膜早破，甚至造成胎死宫内等一系列不良后果。在分娩过程中，胎儿经产道娩出时，也易被感染。常见的有新生儿眼炎，其次为新生儿呼吸道感染，其他还有中耳炎、咽喉炎等。因此对解尿支原体感染的早期诊断及时预防和治疗甚为重要。由于荧光PCR法敏感性高，因此是最有效的早期诊断方法，有利于病人的早诊早治。2）有利于无症状诊断。解脲支原体感染后，患者大多无明显症状，因此，