第八章 糖和苷-2.ppt

1 8 4糖和苷的分离方法 I 按分离原理 或分离方法 分类 8 4 1利用溶解度差异分离8 4 2利用酸碱性差异分离或解离度8 4 3利用吸附性差异分离8 4 4利用分子量差异分离 8 4 2利用酸碱性或解离度差异分离利用酸碱性差异8 4 2 1铅盐沉淀法 同前述 8 4 2 2季铵盐 氢氧化物沉淀法利用解离度差异8 4 2 3离子交换法 1 离子交换法 2 离子交换纤维素层析法 3 使用硼酸处理的强碱性阴离子交换树脂法 8 4 2 2季铵盐 氢氧化物沉淀法是一类乳化剂结构式见教材应用 可将酸性多糖从中性多糖中分离 并可再进一步细分为 不同类别的多糖 原理 1 季铵盐 氢氧化物通常只与酸性多糖生成沉淀 使之分离 方法 控制季铵氢氧化物浓度可得到不同酸性多糖 控制pH 9 2 升高PH 某些中性糖也能被沉淀 OH的解离度增大 方法 在不同pH下分步沉淀 酸性 中性 碱性等 得到不同多糖 季铵盐 氢氧化物pH梯度沉淀加入硼砂缓冲液 某些中性糖也能被沉淀原理 糖与硼酸络和 增强酸度 P 76 利用解离度差异 8 4 2 3离子交换法 应用 1 去杂质 可解离杂质 2 分离糖类 1 离子交换法 2 离子交换纤维素层析法 3 使用硼酸处理的强碱性阴离子交换树脂层析法 去除 选用 得到 注意事项 去杂质 可解离杂质 酸 碱 盐 1 离子交换法 多糖 苷 供进一步分离 树脂选型 增大其解离度 分离糖类 酸性糖碱性糖中性糖 是否解离选用方法 解离 解离 2 离子交换纤维素层析法 不解离 改进 3 硼酸处理的强碱性阴离子交换树脂 2 离子交换纤维素层析法 离子交换 纤维素层析 阳离子交换纤维素阴离子交换纤维素常用型号 03 一般了解应用 分离酸性 碱性多糖洗脱方法 不同浓度的缓冲溶液 3 硼酸处理的强碱性阴离子交换树脂原理 中性糖与硼酸络合 NP 77 可增加酸性增大解离度 能选择性交换 洗脱方法 不同浓度的硼酸盐溶液应用 单糖 低聚糖 中性多糖效果好缺点 洗脱体积大后处理烦 8 4 2利用酸碱性或解离度差异分离小结两沉淀 1 铅盐沉淀法 如前述 盐试剂沉淀法 2 季铵氢氧化物沉淀法碱试剂沉淀法三交换 1 离子交换法 2 离子交换纤维素层析法 3 使用硼酸处理的强碱性阴离子交换树脂层析法 11 8 4糖和苷的分离方法 I 按分离原理 或分离方法 分类 8 4 1利用溶解度差异分离8 4 2利用酸碱性差异分离或解离度8 4 3利用吸附性差异分离8 4 4利用分子量差异分离 8 4 3利用吸附性差异 8 4 3 1活性炭吸附法 8 4 3 2纤维素柱层析 静态吸附 动态吸附 应用 注意事项 8 4 3 1静态吸附 去非糖 杂质对水溶性低聚糖几乎无不良影响 须用动物性骨碳否则对蔗糖吸附较多 回收率低 仅43 87 亲脂性 分离单糖和低聚糖 含单糖数目多者 下 先 后 8 4 3 2动态吸附 活性碳柱层析 应用 去杂质 分离糖 去无机盐 水洗最洗下 利用活性炭选择性吸附 先水洗 渐增洗脱液中的乙醇浓度 无机盐先下 然后是单糖 逐步洗出二糖 三糖 及更大低聚糖 洗脱方法 活性炭预处理方法 盐酸液煮沸 蒸馏水洗净 2 3mol L 需要增加洗脱速度 方法 1 加压 2 装柱时 拌入等量硅藻土 弊 会使吸附容量降低 3 或用 目稍粗的炭 注意事项 8 4 3利用吸附性差异 8 4 3 1活性炭吸附法 8 4 3 2纤维素柱层析 静态吸附 动态吸附 洗脱液 水 乙醇 18 8 4糖和苷的分离方法 I 按分离原理 或分离方法 分类 8 4 1利用溶解度差异分离8 4 2利用酸碱性差异分离或解离度8 4 3利用吸附性差异分离8 4 4利用分子量差异分离 8 4 4利用差异 分子量 凝胶层析法 应用 1 去杂质 无机盐及小分子化合物下 进入凝胶内部 方法 后 2 分离糖 苷 注意 比较活性炭吸附法 1 分离分子量不同的糖 苷 例如 低聚糖 苷 或多糖 大分子的糖 洗下 比较活性炭法 大分子 下 先 后 2 分离糖和苷 2 分离形状不同的分子 如直链和支链多糖支链糖 苷 下 先 分离低聚糖和苷 用孔隙 的分离多糖用孔隙 的多糖纯化去小分子杂质用孔隙 的 小 大 小 注意事项 凝胶选型 23 8 4糖和苷的分离方法 I 按分离原理 或分离方法 分类 8 4 1利用溶解度差异分离8 4 2利用酸碱性差异分离或解离度8 4 3利用吸附性差异分离8 4 4利用分子量差异分离 8 5糖和苷的分离方法 II 按分离目的分类 8 5糖和苷的分离方法 II 按分离目的分类 8 5 18 5 2 分离混合糖类或苷类细分总糖 总苷 去非糖 苷杂质精制总糖 总苷 8 5 1除去非糖杂质的方法 制备 精制 总糖 总苷思路 寻找差异首先要考虑性质差异 成分亲水 亲脂酸碱性解离度分子量 分离方法 不解离可解离 多为中 高分子量 亲脂类亲水类 可解离电解质酸碱盐不解离 成分溶解性 极性酸碱性解离度分子量 亲水 中性酸性 酸性碱性中性 极性大 极性较大 小分子或大分子 中性酸性 成分亲水 亲脂酸碱性解离度分子量 亲水 中性酸性 酸性碱性中性 极性大 极性较大 不解离 小分子或大分子 分离方法 利用差异 注意正确判断差异类型 分离目的方法举例 除亲脂性杂质 溶剂法吸附法 亲脂性溶剂抽提 萃取 例如石油醚脱脂 活性炭吸附静态 极性 糖和苷的精制 除亲水性杂质 利用差异 极性 溶剂法吸附法 正丁醇萃取 精制苷 水溶醇沉 精制多糖 活性炭柱层析 成分亲水 亲脂酸碱性解离度分子量 亲水 中性酸性 酸性碱性中性 极性大 极性较大 不解离 小分子或大分子 分离方法 不沉淀 酸碱性成分被交换吸附 中性糖 苷成分流出除酸性成分 离子树脂除碱性成分 离子树脂 除去酸碱性杂质及部分中性杂质 铅盐沉淀 酸性 酚性成分含酸性多糖 酸根 阴 阳离子 阳 法 离子交换法 碱式醋酸铅 中性醋酸铅 另沉淀中性 成分含中性多糖 目的方法分离效果等 沉淀 单糖 低聚糖 极性大的苷 成分亲水 亲脂酸碱性解离度分子量 亲水 中性酸性 酸性碱性中性 极性大 极性较大 不解离 小分子或大分子 分离方法 分离目的分离方法洗脱顺序及原理 除无机盐 离子交换法活性碳层析凝胶层析 后下先下后下 被交换吸附 分子量小吸附弱 进入凝胶内部 可解离小分子 成分亲水 亲脂酸碱性解离度分子量 亲水 中性酸性 酸性碱性中性 极性大 极性较大 不解离 小分子或大分子 分离方法 分子量大的杂质下分子量小的杂质下 醇沉蛋白沉淀剂透析法 凝胶法活性炭 沉淀多糖 蛋白质精制单糖低聚糖和苷用于精制多糖 只沉蛋白 不沉多糖 思考题 分离多糖等大分子水溶液时脱盐可以选用的方法有哪些 简述其原理 要点 透析 超滤 凝胶层析 离子交换 活性炭层析 不解离可解离 杂质 亲脂亲水 可解离电解质酸碱盐 成分溶解性酸碱性解离度分子量 亲水 多中性 酸性碱性中性 极性大 极性较大 不解离 小分子或大分子 方法 中性酸性 不解离可解离 杂质 亲脂亲水 可解离电解质酸碱盐 成分溶解性酸碱性解离度分子量 亲水 多中性 酸性碱性中性 极性大 极性较大 不解离 小分子或大分子 方法 中性酸性 溶剂法吸附法 分级醇沉蛋白沉淀剂凝胶活性炭 离子交换法凝胶层析法活性炭层析 铅盐沉淀离子交换 8 5 2分离混合糖类或苷类 细分总糖 总苷 8 5 2 1先粗分为单糖 低聚糖 多糖1醇沉法 糖可溶 糖沉淀 多 单糖 低聚 小 多 2活性炭层析3凝胶层析法选用 孔隙 糖先下 8 5 2 2再细分单糖 低聚糖 活性炭层析 吸附性差异凝胶层析 分子量差异选用孔隙小的凝胶离子交换层析 解离度差异离子交换纤维素硼酸处理树脂 8 5 2 3多糖再分离 粗分 醇沉 乙醇分级沉淀法 或乙醚分段沉淀法 不同分子量 季铵氢氧化物分段沉淀法不同酸碱性细分 离子交换纤维素层析法 凝胶层析法5纤维素柱层析法6硼酸处理的树脂 8 5 2分离混合糖类或苷类 细分总糖 总苷 8 5 2 4总苷的细分1分配柱层析法正相分配反相分配 2聚酰胺柱层析法3活性炭柱层析法4凝胶柱层析法 在提取分离之中 怎样确认中间产物中是否含有糖或苷 在提取分离之后 如何确认终产品中是否含有糖或苷 44 第八章糖和苷 8 1结构与分类掌握 8 2理化性质熟悉 了解 8 3提取方法掌握 8 4分离方法 I 掌握 8 5分离方法 II 掌握 各论 8 6检识方法熟悉 了解 8 5 1一般检识方法 通用方法 8 5 1 1显色反应8 5 1 2纯度鉴定8 5 1 3分子量测定8 5 特征检识方法8 5 1还原糖检识8 5 2非还原糖检识 包括苷 8 5 3单糖与结合糖区别检识8 5 4其它专属性检查 8 5糖和苷的检识方法 回顾 有机 糖和苷检识方法Molish反应脱水反应 糠醛形成反应 NP 73 呋喃甲醛 糠醛 5 羟甲糠醛5 HMFA 8 5 1一般检识方法 通用方法 8 5 1 1显色反应 糠醛形成反应 脱水反应 方法与现象 以Molish反应为例 中药水提液 加 萘酚 滴 摇匀 装试管 沿管壁加入浓H2SO4 两溶液交界面产生有色环 紫红色或其它色 2 原理主要过程 水解 脱水 缩合 结合糖 低聚糖 多糖 苷 浓无机酸 单糖 浓无机酸 脱水 糠醛或其衍生物 酚类试剂 缩合 有色物 水解 3 分类与特点 了解 2 Seliwanoff反应 西里瓦诺夫反应 用 盐酸 间苯二酚 条件温和 各种单糖显色时间及颜色不同 4 试剂 无机酸酚类 芳胺等 1 Molish反应 用浓H2SO4 萘酚迅速脱水 各种单糖无明显差异 通用型 Molish反应阳性 表明有糖或苷存在 糖包括各种游离糖 结合糖 Seliwanoff反应阳性 区别某些不同的单糖 反应时间 颜色不同 5 结果判断 适用范围 应用 了解 8 5 1一般检识方法 通用方法 8 5 1 1显色反应Molish反应 8 5 1 2纯度鉴定8 5 1 3分子量测定 8 5 1 2纯度鉴定 区别单一成分或混合物 1 层析法 多用于单糖的鉴定 可用标准品对照 1 平面层析 应有圆整斑点 且无杂质斑点出现展开剂 常用 n BuOH HOAc H2O 上层 等硅胶 n BuOH Me2CO H2O 等显色剂 苯胺 邻苯二甲酸等 不同的单糖常显不同颜色其它 纤维素 2 柱层析 单峰 较锐 2 其它方法 NP 92 多糖鉴定常用 比旋度 应恒定示差折射法 折光率不变水解法 糖组成恒定 8 5 1一般检识方法 通用方法 8 5 1 1显色反应Molish反应 8 5 1 2纯度鉴定8 5 1 3分子量测定 8 5 1 3分子量测定NP 91P 105了解 由分子量可明显区分单糖 低聚糖 多糖1 物理方法粘度法等2 质谱法 实用 可联用 气质联用 液质联用 3 凝胶层析法测多糖分子量 需标准品做标准曲线对照 8 5 1一般检识方法 通用方法 8 5 1 1显色反应8 5 1 2纯度鉴定8 5 1 3分子量测定 8 5糖和苷的检识方法 8 5 特征检识方法8 5 1还原糖检识8 5 2非还原糖检识 包括苷 8 5 3单糖与结合糖区别检识8 5 4其它专属性检查 8 5 特征检识方法 中药水提液 Fehling试剂 Fehling试剂 弱氧化剂 CuSO4与酒石酸钾钠的碱溶液混合而成 8 5 1还原糖检识 Fehling 斐林 反应 方法与现象 区分不同种类的糖以及糖和苷 醛氧化成 COOH u2 被还原成Cu 析出沉淀 砖红色 醛的 CHO上连有 原子 易被氧化 CHO C O 2 原理 了解 故醛糖呈阳性反应 然而果糖等酮糖也能呈阳性反应 较弱的氧化剂如Tollen 土伦试剂 Fehling溶液即可将醛氧化成相应的羧酸 果糖等酮糖也能呈阳性反应 在碱溶液中醛糖和酮糖能发生互变重排可异构化成含醛糖的混合物 Fehling反应小结 醛阳性 酮阴性醛糖 酮糖都阳性 酮糖在碱性溶液中异构化 3 结果判断 在糠醛形成反应之后 进一步区分还原糖与非还原糖 大多为结合糖 或苷阳性 有砖红色Cu2O沉淀 则表明有还原糖存在 即单糖 含 醛的醛糖 含 酮的酮糖 或还原性双糖 天然三糖及其以上 皆为非还原性糖 大多是在蔗糖的基础上延长糖链 阴性 可能是非还原性糖或苷类 非还原性低聚糖 多糖 还需结合下述8 5 2中的酸水解方法进一步确认 8 5 2非还原糖检识 包括苷 Fehling试验之反应液 过滤 滤液 加酸 水解 观察 放冷 有沉淀或絮状物 无沉淀或絮状物 过滤 沉淀 滤液 Fehling试验 观察是否阳性 Fehling反应 酸水解法 方法与现象 Fehling试验 结果判断 原理 苷 水解 苷元 一般难溶于水 有沉淀 结合糖 水解 单糖 水溶性好 无沉淀 1 观察水解液放冷后有无沉淀 可区别苷与糖如有沉淀或絮状物产生 可能含苷如无沉淀或絮状物产生 一般不含苷 2 如果水解前Fehling试验阴性 水解后Fehling试验阳性 则可能含有非还原糖 包括苷 8 5 3单糖与结合糖区别检识 样品酸水解后 层析斑点增多 为 糖 结合 层析斑点不变 为 糖 单 酸水解 平面层析法 Rf 8 5 4其它专属性检查 对上述水解所得沉淀 滤液 以及原提取液 还可酌情进行