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第十三章 答案一、填充题15端 3端2核心酶 3鹅膏蕈碱（-amanitin）4Thr-Ser-Pro-Tyr-Ser-Pro 磷酸化位点5嘌呤核苷酸6Pribonow box TATAT7基因内启动子8将RNA聚合酶引向启动子 调节RNA聚合酶的活性9tRNA 依赖于RNA的DNA聚合酶 依赖于DNA的DNA聚合酶 RNase H Oligo dT10增强子 HSE GC box CAT box11带帽 加尾 内部甲基化 剪接 编辑12RNA 蛋白质 RNA Pro-tRNA的5端13鸟苷酸或鸟苷14AAUAA GU-AG15依赖于终止子 依赖于rho因子16不同mRNA后加工的中间产物17R环技术18Gag pol env19CD4+-T淋巴细胞20TBP21RNA 复制或反转录缺乏自我校对机制22小分子的细胞核RNA 参与Pre-mRNA的剪接23小分子的细胞核仁RNA 参与真核细胞Pre-rRNA的后加工（甲基化）24编辑25长的末端重复序列 增强子 启动子26提供某些mRNA编辑所需要的模板27核酸酶S1 mapping二、是非题1、错。原核细胞的RNA聚合酶能够直接识别启动子，并与启动子结合，但真核细胞的三种RNA聚合酶并不能识别启动子，它们与启动子的结合需要特殊的转录因子的帮助。2、错。原核基因的转录一般是形成56个磷酸二脂键以后因子才与核心酶解离。3、对。4、错。不同的基因使用不同的链作为其编码链和模板链。5、对。RNA聚合酶缺乏35的外切酶的活性，因为不能够去除转录过程中错误掺入的核苷酸。6、错。28S rRNA、18S rRNA和5.8 rRNA作为一个多顺反子，由RNA聚合酶I催化转录，5S rRNA是一种小分子RNA，由RNA聚合酶III催化转录。7、错。真核细胞mRNA加尾反应中的Poly A聚合酶并不需要模板。8、错。利福霉素抑制原核细胞转录的起始阶段，利链霉素则抑制延伸阶段。9、错。许多RNA病毒通过RNA复制进行增值。10、错。HIV是一种逆转录病毒，但并不是肿瘤病毒。11、对。原核细胞RNA全酶分子中的因子只参与转录的起始，当起始完成以后即与核心酶解离。并可以重新利用参与新一轮的转录起始，因此它的浓度不需要与核心酶一样。12、对。反转录病毒基因组RNA的5端具有帽子结构，3端具有Poly A尾巴，基因组中都含有gag、pol和env三个基因，因此它实际上就是一种多顺反子mRNA。13、错。在一种黏细菌细胞内，发现有一种特殊的分支核酸分子的存在，这种核酸就是通过反转录过程形成的。14、错。某些ribozyme也可以以非RNA分子作为底物。15错。Ribozyme与蛋白类酶一样，也需要有正确的三维结构，才会有活性。16错。某些SnRNA的5端也有帽子结构。17错。某些tRNA基因编码链上就含有CCA序列，他不需要通过后加工的方式产生。18对。线粒体内的蛋白质有许多由细胞核基因编码，包括他的RNA聚合酶。19对。四膜虫Pre-rRNA的剪接实质上是一系列的转脂反应，不需要消耗ATP。20错。某些内含子在特定的条件下可作为外显子编码氨基酸。21错。真核细胞mRNA的后加工方式有一种内部甲基化形式，它既可以发生在内含子上，也可以发生在外显子上，被甲基化的碱基是A（m6A）22对。某些tRNA基因的突变可使得这种tRNA具有四个核苷酸的密码子。23错。线粒体基因组含有的基因数目有限，催化转录的RNA聚合酶只有一条单链组成，是一种单体酶。24对。放线菌素D的作用机理是嵌入DNA链相连的G-C碱基处，阻止RNA聚合酶向前移动，从而抑制基因的转录。显然这一点对原核生物的DNA和真核生物的DNA都有效。25对。26错。某些DNA病毒，如乙型肝炎病毒（HBV）和花椰菜镶嵌病毒（CaMV）尽管都是DNA病毒，但它们的生活史中有DNARNADNA的过程，其中RNADNA就是反转录。三、选择题1C 7SL RNA由RNA聚合酶III所负责转录，而RNA聚合酶III对中等浓度的-amanitin是敏感的。福利霉素和AZT分别是原核RNA聚合酶和反转录酶的抑制剂。2C 高盐可中和多聚核苷酸链上磷酸根的负电荷，有利于互补链的结合。3D 带帽是一个共转录的后加工方式，它首先发生，其次是加尾，然后是剪接，最后才是运输出细胞核。4E TBP是三种RNA聚合酶都需要的转录因子，因此它的失活可影响到三类基因的转录，当然最容易产生致死型突变。5D 几种SnRNP在剪接反应中功能是不同的：U1 SnRNP识别5剪接点，U2 SnRNP识别分支点，U4/U6 SnRNP负责剪接体的组装，而U5 SnRNP识别3剪接点。6D 已有证明表明SnRNA的正确折叠对于Pre-mRNA的剪接非常重要，SnRNP中的蛋白质似乎对SnRNA的正确折叠有所贡献。7D 几种转录因子具有不同的生物活性，只有TF II具有CTD蛋白质激酶活性，催化RNA聚合酶IICTD上的Ser/Thr进行磷酸化修饰，从而调节RNA聚合酶II的活性。8D 真核细胞28S rRNA、18S rRNA和5.8S rRNA作为一个多顺反子由RNA聚合酶I催化转录，5S rRNA作为一种小分子RNA由RNA聚合酶III负责催化。9D 大肠杆菌RNA聚合酶全酶上的不同亚甲基的功能是有区别的：亚基是一种碱性蛋白能够与DNA结合，亚基含有聚合酶的活性中心，负责全酶的组装和链的起始，因子负责识别起动子，因子并不是聚合酶的组分。10A mRNA的碱基组成应该与它的基因的编码链是一致的，只不过是由U代替了T。11E AZT对人细胞的DNA聚合酶的Km值远大于对HIV逆转录酶的Km值，意味着AZT对HIV逆转录酶的亲和力远大于它对宿主细胞的DNA聚合酶的亲和力。在宿主细胞内它优先与逆转录酶结合，而阻止HIV RNA的cDNA的正常合成。但如果AZT的浓度过高，同样也会抑制宿主细胞DNA的复制。12C 增强子是调节基因转录的碱基序列，与mRNA的翻译无关。13E 原癌基因的过分表达或突变都可以导致细胞的癌变，当反转录病毒整合到原癌基因的上游，它的LTP序列含有增强子，可刺激原癌基因的表达。14D AGGTCAnnnTGACCT是一段回文序列，当将它反方向插到启动子上游的时候，理应对两侧基因的表达没有影响。15D 细菌转录的终止机制有两种：一种依赖于终止子序列；另一种依赖于一种被称为rho因子的蛋白质。四、问答题1用放射性标记的NTP（如-32P-NTP）脉冲标记细胞，然后杀死细胞，提取其RNA，再使用弱碱水解。细胞在脉冲标记时间内每一条RNA链上被掺入的核苷酸数目即为水解物中被标记的核苷酸pmoles除以核苷酸的总pmoles。2首先确定好反应的条件，以保证只有你所需要的克隆基因的才能够转录。然后将模板、RNA聚合酶和三种NTP混合，注意控制模板的量不要太多，以使转录的基因数大约等于模板数。最后在反应混合物中加入第四种NTP，然后开始计时，一段时间后终止反应，进行凝胶电泳，确定被合成的RNA的长度。3将cordycepin（冬虫夏草素，3-脱氧腺苷）加到细胞内，在细胞内它将通过核苷酸合成的补救途径生成相应的3-脱氧腺苷三磷酸。如果它能够造成末端终止，则转录的方向是53，因为当RNA转录的方向是35时，3-脱氧腺苷酸无法掺入到RNA链的生长端（无3-羟基，不能与前一个核苷酸形成3,5-磷酸二脂键），即5端，因此不可能造成末端终止。4当RNA聚合酶在催化转录的过程中暂停现象，则转录的速度将低于无暂停的RNA聚合酶催化转录的速度，这样在相同的时间内，转录物的长多将比一般转录物的长度短。使用放射性补救的NTP标记转录产物，然后进行凝胶电泳和放射性自显影，有暂停现象的转录物的条带位置将会超前。5RNA聚合酶对NTP的Km值在起始阶段高于延伸阶段意味着RNA聚合酶在延伸阶段对NTP的亲和力高于起始阶段RNA聚合酶对NTP亲和力，在NTP的浓度不高的情况下，不多的NTP优先与催化延伸反应的RNA聚合酶结合。当细胞内的NTP浓度较低的时候，这显然可以保证已进入延伸阶段的转录反应能够最终完成，这时新的基因转录的起始受到限制。6人工合成与你想刺激转录的目的基因的模板链的前二个核苷酸互补的二聚核苷酸，将此二聚核苷酸加到体外转录系统之中，这时二聚核苷酸将与你的目的基因编码链的前二个核苷酸互补结合，RNA聚合酶在启动转录以后，将不需要合成这两个核苷酸，而直接掺入第三个核苷酸，当反应混合物中的NTP浓度不高的情况下，目的基因却能有效地进行转录。7使用足印法（footprinting）进行确定：如果阻遏蛋白是通过阻止RNA聚合酶与启动子的结合来抑制乳糖操纵子的结构基因转录的，则高浓度的遏制蛋白的存在将会竞争性抑制RNA聚合酶与启动子的结合；如果阻遏蛋白允许基因转录的起始但通过与操纵子结合抑制转录的延伸，则不会出现上述现象。也可以通过相关的基因在体外转录进行确定：观察在无阻遏蛋白的情况下，被转录的区域是否包括操纵子序列。8顺式作用元件是负责调解基因转录的特殊的碱基序列，如HRE（激素反应元件）、HSE（热休克反应元件）和增强子等。反应作用因子的即是能够与顺式作用元件特异性结合的蛋白质因子，如脂溶性激素的受体。通过mobility shift分析可以得到与一种顺式作用元件特异性结合的反式作用因子：当顺式作用元件结合上反式作用因子以后，其电泳性质将会发生变化，其条带位置将会改变。在有对照的条件下，进行电泳，找出泳动滞后的条带，分离结合的蛋白质。也可以使用亲和层析法将顺式作用元件共价偶联到特殊载体上，让细胞核抽取物通过此层析柱，能够与顺式作用元件特异性结合的蛋白质被吸附，这种蛋白质即是要的反式作用因子。同样可以使用上面的方法得到顺式作用元件。9根据增强子、沉默子和启动子的不同性质进行确定。增强子和沉默子与启动子的主要差别是启动子与他所控制转录的基因之间在方向和距离上有严格的要求，而增强子和启动子与距离、方向无关。这样可以通过改变未知功能的顺式作用元件与报告基因（reporter gene）的距离和方向，观察报告基因的表达所发生的变化来确定新发现的顺式作用元件究竟属于哪一类。10首先通过电泳得到第二类内含子或第三类内含子剪接的中间物，然后割下怀疑为套索结构的条带，回收并纯化凝胶带中的RNA，将得到的RNA与35核酸外切酶一起保温。假如该RNA成套索结构，则35核酸外切酶不可能将它彻底地水解，当水解到一定阶段，肯定会留下一段能够抵抗外切酶作用的序列。11制备U1、U2、U4/U6或U5 SnRNP的单克隆抗体，将各单克隆抗体加到特定的剪接系统之中。如果上述几种SnRNP的确参与剪接，则相应的单抗必定会影响剪接反应。也可以合成与各SnRNP复合体中的SnRNA互补的DNA片段，然后将它们混合，加入的DNA将会与相应的SnRNA配对，随后加入RNase H，RNase H将会水解SnRNA，如果某种SnRNP参与剪接，则当它的RNA被RNase H水解以后，剪接反应将会受影响。12核酶即是具有催化活性的RNA分子。已发现的天然核酶包括：第一类内含子，第二类内含子，具有锤头结构的核酶（如某些类病毒的基因组RNA和病毒相关的卫星RNA），原核细胞的23S rRNA，肝炎病毒RNA，RNase P以及苯丙氨酸tRNA等。与蛋白类酶一样，核酶功能的正常发挥也需要正确的三维结构的存在，但是核酶通常使用RNA作为底物，催化的反应一般是水解反应，而且，有的核酶在无蛋白质存在的情况下，催化效率不高，这些都是和蛋白类酶不同的地方。关于核酶的催化机理，尚不十分清楚。核酶的发现意义重大，他不仅改变人们对酶都是蛋白质的传统观念，而且对探索生命的起源很有启发。很可能在细胞出现之前，曾有过所谓的“RNA世界”，这个阶段的RNA不仅充当遗传物质，而且具有催化功能。13大肠杆菌rRNA后加工并非绝对发生在转录以后，一些后加工反应在转录还没有完成的时候就已经开始，其中包括某些剪接反应，因此在野生型大肠杆菌体内，等转录结束后得到的并不是原始的初级转录物。只有大肠杆菌某些参与后加工的酶有缺陷以后，才有可能得到真正的初级转录物。14大肠杆菌体内降解物活化的操纵子的转录与CAP（降解物激活蛋白）和cAMP形成的复合物与相关基因上游的特殊序列之间的结合有关。CAP不同于阻遏蛋白，它是一种二聚体的激活蛋白，当它结合了cAMP以后，其构象发生变化从而能够与DNA上一段长为30bp的特殊的呈回文排列的碱基序列结合。当它结合以上以后，会诱导这段DNA环绕其上，并弯曲约90的角。这种弯曲在刺激RNA聚合酶活性方面起着重要的作用。作为大肠杆菌细胞内的拓扑异构酶II，即旋转酶可能参与调节此处DNA的弯曲。因此抑制它的DNA旋转酶（gyrase）的活性就会抑制受降解物活化的操纵子的转录。15只是通过选择性剪接产生的。在长的转录物中，一含有终止密码子的内含子没有被除去，仍然保留在成熟的mRNA之中。当它作为模板被翻译的时候，会提前遇到终止密码子，因而翻译的终产物的肽段要短；而在短的转录物中，含有终止密码子的内含子已被去除。当它作为模板被翻译的时候，不会提前结束，因而翻译出来的产物反而比长转录物翻译出来的产物长。16在给定的时间内，尽管细菌合成的RNA中约有40%50%是mRNA，但转录出来的mRNA很容易水解，甚至在其3端还没有合成好，5端就开始水解。因而它的半寿期极短，在细胞中不容易积累，只占细胞总RNA的很小的一部分。然而，虽然tRNA和rRNA转录的效率低，但是稳定性高于mRNA，所以它们在细胞中容易堆积，占细胞总RNA的比例反而大。 与原核细胞的mRNA相比，真核细胞mRNA的5端有帽子结构，3端有poly A尾巴的保护，因而其稳定性要比原核细胞mRNA高的多。因此它占细胞中总DNA的比例应高于原核细胞。17（1）1、2、3和4分别表示DNA的模板链、RNA聚合酶、mRNA和核糖体。 （2）DNA的模板链或无意义链的5端和3端分别对应于图上的右端和左端。 （3）（4）（5）（6）见下图： 3端 （RNA聚合酶的移动方向） 5端 C端N端（7）真核生物不可能具有这样的结构图，这是因为真核生物的转录与翻译不存在偶联关系。18组蛋白的合成与DNA的复制是高度同步的，都集中在细胞周期的S期。在合成以后两者要组装成核小体的结构，这需要在较短的时间内合成大量的组蛋白。组蛋白的基因的结构所具有的一些不同寻常的性质，比如基因的拷贝数属于中等拷贝。基因无内含子以及它的成熟的mRNA无poly A尾巴等似乎都与使得它能够在短时间内得到大量拷贝的成熟mRNA有关。组蛋白mRNA的5端仍然保持戴帽反应，这也可以得到解释，因为戴帽反应是一种共转录反应，它并不需要专门的时间来完成。19测定不同长度poly A尾巴的mRNA的分布及其相对含量，如果能够发现细胞内缺乏一定长度以下的mRNA的存在，那么就说明题中的假设是正确的。20原核生物基因启动子的一致序列（consensus sequence）是：-35区为TTGACA，-10区位TATAAT。一个基因的启动子序列越接近上述一致序列，则转录的效率就越高，反之就低。Tac启动子融合了乳糖启动子的-35区序列和色氨酸启动子的-10区序列，它与一致序列非常接近。而乳糖启动子的-10区和色氨酸启动子的-36区序列与一致序列中相应的序列差别比较大。因此当将Tac启动子引入一表达质粒之中以后，它引导基因转录的效率比乳糖启动子或色氨酸启动子都要高。21无论是催化RNA病毒复制的RNA复制酶，还是催化反转录RNA病毒的逆转录酶都没有35核酸外切酶的活性，因此当RNA进行复制或者RNA进行反转录的时候，错误掺入的核苷酸无法通过校对的机制除去。因而RNA病毒极容易突变。当发生的突变是有害的突变的时候，其生存就会受到影响。显然如果RNA病毒基因组越大，则复制或逆转录发生错误的机会就越大，因而更容易发生突变；反之，发生突变的可能性就低。所以RNA病毒基因组大都比较小，是有利于它的生存的。22反转位子是一种特殊的转为子，其拷贝的复制经历了从DNARNADNA的过程。其中RNADNA就是反转录反应，因而这种转位子被称为反转位子或逆转位子。确定一个转位子是不是反转位子可以在其序列的内部导入内含子，如果是反转位子，则经过转录后，其内含子会通过剪接的方式被去除，这样新出现的拷贝就不应该具有内含子序列；反之原来的内含子序列会得到保留。此外还可以将此转位子序列受控于可诱导的调控序列。当细胞缺乏诱导物的情况下，该转位子序列不会被有效的转录，当然也就不会进行反转录，因此在这种条件下，转位的概率很低；相反，当细胞被提供诱导物的情况下，该转位子序列就能够被有效的转录，此时，转为的效率应有所提高。23HIV是一种反转录病毒，它的宿主细胞为CD4+-T淋巴细胞。它的生活史包括以下几个阶段：（1）感染宿主细胞。主要通过血液途径感染，也可通过母婴垂直感染。HIV热感宿主细胞是一种受体介导的过程。其中配体是其外膜上的gp120，受体是宿主细胞膜上的CD4+蛋白，此外还需要辅助受体。（2）反转录过程。在反转录酶的催化下，以其基因组RNA作为模板，合成两端带有LTR序列的双链DNA。（3）在整合酶的催化下，通过反转录合成的双链DNA随机整合到宿主细胞染色体DNA上。（4）HIV基因的转录、转录后加工、翻译、翻译后加工。其中病毒的外壳蛋白的成熟这一步尤其重要，它是在一种由病毒基因组编码的蛋白酶的崔哈下完成的。（5）新的病毒颗粒的包装，并以出芽的方式从细胞中分泌出去。 艾滋