鮟鱇鱼糖氨聚糖提取及其结构和活性的质谱研究.doc

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第3页同行评议组别食品（农产品、水产品）加工与储藏项目编号Y305348浙江省自然科学基金申 请 书申报类别:一般项目项目名称:鮟鱇鱼糖氨聚糖提取及其结构和活性的质谱研究申 请 者:张虹电 话8598依托单位:浙江工商大学通信地址:杭州市教工路149#浙江工商大学 食品、生物与环境工程学院邮政编码:310035E-mail :申报日期:2005-5-26浙江省自然科学基金委员会二OO五年制基本信息申请者信息姓 名张虹性别女出生日期1962年08月31日最终学位博士获学位年份2004职称副教授主要研究领域食品新资源研究与开发；食品质量与安全E-电 8598个人网页 依托单位浙江工商大学证件类型身份证证件号码110107620831064申请者是否近三年调入在浙单位工作否调入时间 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限:“出口优势水产品（头足类）精深加工关键技术及系列产品研究”，项目编号2004 C12004，是浙江省科技厅招标项目，起止年月为2004-2005年，项目申请人张虹负责加工副产品的开发利用部分。项目基本信息项目名称鮟鱇鱼糖氨聚糖提取及其结构和活性的质谱研究申报类别一般项目研究属性前瞻性应用基础研究同行评议组别农业科学及生物技术/食品（农产品、水产品）加工与储F依托基地名称 预计研究年限2006年01月2007年12月总经费预算10.0万元申请经费8.0万元项目研究目标、内容和意义简介(限400字) 本项目利用非降解法、酶处理法和碱处理法从加工鮟鱇鱼的副产品中提取鮟鱇鱼糖氨聚糖，并对其进行分离纯化；对获得的各种鮟鱇鱼糖氨聚糖的分子量、组成、分子结构，采用质谱等方法鉴定；以鮟鱇鱼糖氨聚糖结构研究为基础，利用质谱技术研究鮟鱇鱼糖氨聚糖与金属离子、肽或蛋白质的相互作用活性，发展一套稳定、快速可用于糖氨聚糖结构及其非共价复合物活性分析的质谱分析方法，为进一步研究糖氨聚糖生物活性及其变化规律提供理论和技术支持。 我省鮟鱇鱼肉加工的的大省，加工时的副产品数量较大，开发利用其加工副产品生产糖氨聚糖，可增加鮟鱇鱼这类低值水产品加工的附加值，促进我省水产品加工产业向精深加工方向的快速发展。 本项目研究成果不仅为糖氨聚糖生物活性的研究提供理论依据，为新型功能性食品和药物产品的开发及研制奠定基础，同时也不同来源的其它多糖的质谱分析、研究提供参考。关键词（不超过4个）鮟鱇鱼糖氨聚糖;提取；质谱分析；非共价复合物同行评议分组说明水产品加工与保鲜技术 重点资助方向 申请书版本号：92804700 项目组主要成员编号姓名出生日期性别职称学位单位名称电话项目分工每年工作时间（月）（(月)1张虹1962年08月31日女副教授博士浙江工商大8598负责人82戴志远1958.06.01男教授学士浙江工商大学88071024-8587糖氨多糖分离53王宏海1976.11.09男助理工程师学士浙江工商大学88071024-8587糖氨多糖分离104洪詠平1945.05.27女副教授学士浙江工商大学88071024-8587结构鉴定55孔祥盈1982.03.10男硕士生学士浙江工商大学88071024-8598结构鉴定106张小军1982.14.11男硕士生学士浙江工商大学88071024-8598质谱分析107吴学美1982.02.07女硕士生学士浙江工商大学88071024-8598质谱分析10总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数73010031说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版） 第12页个人介绍：张虹：项目申请人张虹，女，1962年生，博士，副教授。杭州商学院肉食品卫生检验专业学士，浙江大学药物分析专业硕士，浙江大学化学博士。1985年大学毕业后，曾任北京市化工研究院工程师，期间作为访问学者赴美国农业部南方研究中心从事研究工作。1996年后，调入浙江工商大学担任仪器分析、食品营养学等课程的本科生及研究生教学工作。现任浙江工商大学水产品加工研究中心副主任，食品质量与安全系副教授。先后承担数项省、部科研项目，并在Analytical biochemistry、Journal of Food Science、Chemistry of natural compounds、科学通报、分析化学、食品科学、营养学报等国内外杂志上发表论文40余篇。近年来，在“低值鱼发酵制品功能性研究与应用”及“鮟鱇鱼精深加工技术研究”项目的研究中，进行了与本项目相关的工作。前者，利用动物模型评价了低值鱼发酵制品辅助降血糖、调血脂的作用；以体外模型，评价了低值鱼发酵制品调血压功能；后者，即在鮟鱇鱼精深加工技术研究中初步获得了鮟鱇鱼软骨素。在博士就读期间，进行了多种与项目有关的研究工作，例如：“拓扑异构酶作为靶分子的HPLC/MS酶亲和超滤筛选”，“抗体作为靶分子的HPLC/MS免疫亲和超滤高通量筛选”。并完成了博士论文“HPLC/MS在天然来源生物活性成分快速筛选中的应用研究”，大部分研究是已质谱和色谱为手段研究药物小分子与酶或抗体等生物大分子之间的相互作用性质，与本项目使用的技术手段相同。上述研究工作为本项目的研究打下了基础，申请人完全有能力完成本项目的研究工作。项目申请人在近3年发表了多篇与本项目有关的论著，其中3篇被SCI收录，一篇被EI收录。论文详见下表：1. Hong Zhang, Qing gu, Xinle Liang, Yuanjiang Pan. Screening for TopoisomeraseBinding Compounds by HPLC-MS. Analytical Biochemistry. 2004.Vol.329(2):173-179 2. Zhang Hong, Pan Yuan-jiang. Affinity ultrafiltration of DNA topoisomerases-targeted compounds determined with HPLC/ESI-MS for drug candidate screening. Journal of Zhejiang University Science. 2004. Vol.5(8): 900-905 3. 张虹，顾青, 潘远江.液质联用方法分析植物愈伤组织中的喜树碱及其衍生物. 分析化学. 2004. Vol.32(12): 16954. Yuanjiang Pan, Hong Zhang, Yaozu Chen.New approach for screening anti-tumor compounds. Chinese Science Bulletin. 2003.Vol.48(7):630-6335.Wan-Xin Wei,Yuan-Jiang Pan,Hong Zhang,Cui Wu Lin,Teng-You Wei. Two New Compounds from Phyllanthus niruri. Chemistry of natural compounds.2004. Vol.40(5):460-464.6.韦万兴,潘远江,张虹,陈耀祖.从珠子草中分离得到的化合物:软木三萜酮在溶液和晶体中的结构.天然产物研究与开发. 2004.Vol.16(3):201-203.7. 潘远江，张虹，陈耀祖. 生物亲和超滤HPLC/ESI-MS快速筛选抗癌活性成分. 科学通报2002.47(17):1, 1305-13088.许刚,张虹,吴延年.大麦叶提取物清除2.-和.的动态研究. 中国粮油学报. 2003.18(2):36-399.许刚，张虹.大麦麦叶中黄酮类化合物清除自由基动态研究. 营养学报. 2003.25(4):401-40410张虹. HPLC/MS在天然来源生物活性成分快速筛选中的应用研究. 浙江大学博士论文。2004.6.戴志远：项目组成员戴志远, 男,1958年出生，教授。 1982浙江水产学院水产加工系毕业。1982至1997年在浙江省海洋水产研究所工作，任水产加工研究室副主任，高级工程师。1997至2000年在宁波大学食品科学研究所工作，任副所长、高级工程师。自2000年起至今在浙江工商大学水产品加工研究所工作，任所长。戴志远教授长期从事水产品加工方面的研究工作，对各种水产品资源的开发利用有独到的见解，在本项目中主要承担从鮟鱇鱼中各种糖氨聚糖的提取工作。 申请经费预算 8.0 万元 计划开支项目名称计算根据及理由金额（万元）1信息费资料费：0.2万，文献检索：0.3万，版面费0.30.82专题学术活动费差旅费：0.6万，会议费0.3万0.93仪器和设备购置费分离装置：1.8万，其它小型仪器：0.32.14能源材料费动力费：0.7万，原材料费：0.5，药品与生化试剂：1.3万，易耗品：0.5万3.05计划管理费5管理费：0.4万0.46人员费研究生培养费：0.8万0.8注：开支范围和标准参见浙江省省级科技项目经费管理暂行办法（浙财教字200220号）。 申请者承诺：我保证： （1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。依托单位公章 日期 .鮟鱇鱼糖氨聚糖提取及其结构和活性的质谱研究1.项目的研究意义鮟鱇鱼属于软骨鱼类，鱼肉不足全鱼体重的1/3，而在其鱼骨、鱼皮甚至内脏等加工副产品（下脚料）中含有大量的不同种类的糖氨聚糖（glycosaminoglycan）。对鮟鱇加工副产品中糖氨聚糖含量的分析时发现，其含量约在0.5-1.5左右，具有较大的开发利用价值，但目前对鮟鱇鱼糖氨聚糖种类、结构特点及其生物活性的研究在国内外均未见报道。自1861年Fischer 和Boedeker从哺乳动物细胞中发现了硫酸软骨素后，人们对鲨鱼及哺乳动物糖氨聚糖的研究逐渐开始，各种不同的糖氨聚糖不断被发现。糖氨聚糖在生物体内，多数情况与蛋白质以共价键形式连接形成特异性的蛋白多糖（proteglycan）；也可与金属离子或肽以共价键或非共价键形式连接。糖氨聚糖生物学作用是多样化的，从组织的水合作用到多种细胞的功能，它与癌症、炎症、皮肤弹性、视觉系统、组织修复和凝血机制等等人体多种生理功能有关。糖氨聚糖不仅其分子结构决定其生物活性，与金属离子、肽、蛋白质非共价作用也影响糖氨聚糖生物活性的变化。因此，研究鮟鱇鱼糖氨聚糖种类、结构特点及其非共价复合物的活性，在提高鮟鱇鱼加工的产品附加值，开发功能食品及新药研究等方面均具有非常重要的意义。目前，最常用的分析糖氨聚糖的结构和糖氨聚糖与其它分子非共价相互作用的方法是核磁共振（NMR）和X-光衍射的方法。这两种方法虽然有效，但费时费力。且用X-光衍射的方法分析的是晶体中的结构，与实际生理状态的结构有一定差别；而NMR在鉴定多糖结构方面，也不如质谱解析清晰。近二十多年来质谱，特别是电喷雾质谱技术的迅速崛起，使质谱成为糖氨聚糖等生物大分子物质分析的强有力的工具。电喷雾质谱技术是一种新发展起来的软电离方法，它的突出特点是可将样品分子从溶液相转化为气态离子，采用此技术能在气相直接测定生理条件溶液中形成的糖氨聚糖等生物大分子和非共价复合物；单个离子可在能量的作用下产生碎片离子，这些碎片离子峰则为结构推断提供信息；通过测定分子量准确区分混合物的不同组分和测定复合物的化学组成；此外，质谱还具有高灵敏度、高分辨率、低样品消耗、分析快速、准确等特点。虽然，目前国内有关糖氨聚糖质谱研究报道并不多见，且鮟鱇鱼糖氨聚糖的质谱研究也未见报道。但根据电喷雾质谱的特点不难判断研究鮟鱇鱼糖氨聚糖分子量、结构及其与金属离子、肽、或蛋白质相互作用活性等，质谱方法将是最有效的工具。近几年，随着着海况的不断变化，我省鮟鱇鱼渔获量的不断提高，鮟鱇鱼的价格相对稳定，作为原料的产品冻鱼肉出口也有所增加。鮟鱇鱼肉加工的副产品的数量急剧增大，开发利用其加工副产品，可增加这类低值水产品加工的附加值。本项目将从鮟鱇鱼肉加工的副产品中提取糖氨聚糖，并以现代质谱技术为主要手段，研究鮟鱇鱼糖氨聚糖的分子量、结构，并在结构研究的基础上研究它与金属离子、肽或蛋白质之间的非共价相互作用。为研制开发新型功能性食品和药物提供理论依据。2项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系 目标： 用加工鮟鱇鱼的副产品提取各种糖氨聚糖并纯化。利用质谱等方法对鮟鱇糖氨聚糖结构分析、鉴定。质谱技术进行鮟鱇鱼糖氨聚糖与金属离子、肽或蛋白质的非共价相互作用活性研究。项目申请者研究工作长期目标是利用本项目研究成果，即用建立的糖氨聚糖质谱分析方法，研究其它水产品中糖氨聚糖结构及其与金属离子、肽或蛋白质的非共价相互作用活性，进而探讨糖氨聚糖和这些非共价复合物的生物活性，并利用加工鮟鱇鱼的副产品开发、生产功能性食品或药品。3项目的研究内容，研究方案和进度安排 项目的研究内容：从加工鮟鱇鱼的副产品中提取各种糖氨聚糖，以非降解法、酶处理和碱处理法等多种方法提取鮟鱇鱼骨、皮或内脏中的各种糖氨聚糖，选择最适的提取方法，确定最佳的提取工艺。并用乙醇沉淀、季铵化合物沉淀或离子交换等方法纯化各种鮟鱇鱼糖氨聚糖，作为备试样品。利用质谱方法结合核磁共振、氨基酸分析及气相色谱方法鉴定鮟鱇鱼糖氨聚糖的分子组成、分子量和分子结构。质谱技术研究各种不同分子鮟鱇鱼糖氨聚糖选择性地与各种金属离子间的相互作用活性，比较其它多糖与上述金属作用时的异同点。质谱技术研究鮟鱇鱼糖氨聚糖与肽或蛋白质的相互作用活性，比较其它多糖与肽或蛋白质作用时的异同点。 研究方案： 本项目从加工鮟鱇鱼的副产品中提取并纯化获得鮟鱇鱼糖氨聚糖，用质谱等手段鉴定鮟鱇鱼糖氨聚糖的结构。以鮟鱇鱼糖氨聚糖结构研究为基础，利用质谱技术研究鮟鱇鱼糖氨聚糖与金属离子、肽或蛋白质的相互作用活性，并比较其它多糖与相同金属离子、肽或蛋白质的相互作用情况，为探讨糖氨聚糖生物活性及其变化规律提供理论依据。 鮟鱇鱼加工中的下脚料，如皮、骨、内脏等技术路线：加工鮟鱇鱼的副产品以非降解法、碱处理法、酶处理法等方法提取鮟鱇鱼糖氨聚糖提取用乙醇沉淀、季铵化合物沉淀或离子交换、凝胶色谱等方法纯化鮟鱇鱼糖氨聚糖纯化用质谱方法、NMR等方法鉴定糖氨聚糖结构研究糖氨聚糖与碱金属、碱土金属、过渡金属、贵重金属间结合的能力，比较其它多糖与上述金属作用时的异同点。与肽或蛋白质的结合模式对空间构象、活性的影响，鮟鱇鱼糖氨聚糖结构鉴定、质谱研究糖氨聚糖与金属离子、肽或蛋白质的相互作用发展一套快速分析糖氨聚糖结构及其非共价复合物活性的质谱方法进度安排： 2006.1-2006.6 鮟鱇鱼糖氨聚糖的提取、纯化 以非降解法、碱处理法、酶处理法等多种方法提取鮟鱇鱼加工副产品中的各种糖氨聚糖，确定最佳的提取方法和工艺，并用离子交换、凝胶色谱等方法纯化鮟鱇糖氨聚糖。 2006.7-2006.12 鮟鱇鱼糖氨聚糖的结构鉴定用质谱方法结合NMR方法、氨基酸分析方法、气相色谱方法分析糖氨聚糖的组成、多糖的序列，并鉴定其组成及结构。 2007.1-2007.4 鮟鱇鱼糖氨聚糖与金属离子间非共价相互作用活性的质谱研究运用质谱技术研究鮟鱇鱼糖氨聚糖选择性地与碱金属、碱土金属、过渡金属、贵重金属间形成非共价复合物的能力。 2007.5-2007.9 鮟鱇鱼糖氨聚糖与肽或蛋白质相互作用活性的质谱研究运用质谱技术研究鮟鱇鱼糖氨聚糖与肽或蛋白质间形成非共价复合物的能力。 2007.10-2007.12鮟鱇鱼糖氨聚糖结构及其复合物质谱分析方法验证对已建立的糖氨聚糖结构及其复合物质谱分析方法进行稳方法验证。4项目创新之处 鮟鱇鱼糖氨聚糖种类及结构研究质谱方法研究鮟鱇鱼糖氨聚糖与金属离子相互作用特点、活性。质谱方法研究鮟鱇鱼糖氨聚糖与肽或蛋白质的相互作用特点、活性。5工作基础与工作条件 项目申请人张虹近年来一直从事质谱、色谱对生物大分子物质及药物分子与生物大分子相互作用研究及生物活性评价方面的研究，熟悉本课题中质谱分析手段和非共价复合物研究方法，并在Analytical biochemistry、Chemistry of natural compounds、科学通报、分析化学等国内外收录的期刊发表过多篇相关的研究论文，对该项目的研究具有一定的工作基础。课题组成员戴志远是水产学科的资深教授水产品中糖氨聚糖的制备方面有丰富的经验，其它成员也在不同的相关领域有着丰富的理论和实践经验。可胜任本项目的研究工作。本研究中所涉及的仪器设备，如可用于各类糖氨聚糖及蛋白等生物大分子物质纯化系统蛋白纯化仪；分析用高效液相色谱仪、气相色谱仪；用于结构鉴定糖氨聚糖与金属离子、肽或蛋白质作用研究的关键设备质谱仪等项目申请人所在的实验室均具备，且另一台适合生物大分子物质分析串联质谱也正在采购中，预计2005年底，即本项目研究开始前可投入使用。本项目组成员的合理配伍及本实验室完善的仪器、设备均为本项目的实施提供了可靠的保障。6预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路项目完成后可从加工鮟鱇鱼的副产品提取、纯化，得到几种不同糖氨聚糖；可确定出鮟鱇鱼糖氨聚糖的结构，并掌握与金属离子、肽或蛋白质间非共价相互作用的活性；并能发展一套稳定、快速可用于糖氨聚糖结构及其非共价复合物活性分析的质谱分析方法。可为今后生物糖氨聚糖活性研究、糖氨聚糖及其它多糖开发、多糖的质谱分析提供理论依据。在国内外重要的学术期刊上发表2-3学术论文。培养本方向研究生3名。7.参考文献1. Anja Gerth, Jens Grosche, Karen nieber and Sunna Hauschildt.Intracellular LPS inhibits the activity of potassium channels and fails to activate NFkB in human macrophages. Journal of Cellular physiology. 2005. 202:442-2522. Baets, S. De.Vandamme, E. J. Biopolymers. Volume6: Polysaccharides : Polysaccharides from Eukaryotes. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA.2002.pp522-5493.Bernfield, M., Gotte, M.,Park, P.w., et al. Function of cell surface heparan sulfate proteglycans. Annu. Rev. Biochem. 1999. 68:729-777. 4.Ganesh Venkataraman, Zachary Shriver,Rahul Raman,and Ram Sasisekharam. Sequencing complex Polysaccharides.5.G.C.Hilton,John M. Martinis, D. A. Wollman,et.al.Impact energy measurement in time-of-flight mass spectrometry with cryogenic microcalormeters. Nuature. 1998.391:672-675.6. Hong Zhang, Qing gu, Xinle Liang, Yuanjiang Pan. Screening for TopoisomeraseBinding Compounds by HPLC-MS. Analytical Biochemistry. 2004.Vol.329(2):173-179 7. Ivan K. Chu, Xu Gio, Tai-Chu Lau and K. W. Michael Siu. Sequencing of argentinated peptides by means of electrospra