饵料质量检测与分析.doc

第一章 饲料质量分析与检验概论第一节 饲料质量分析与检验技术发展史1、简史：18世纪，初步有了评价饲料营养价值的体系；19世纪初, 1864年，Henneberg、Stohmann 在德国的Weende试验站改进并建立了饲料概略成分分析体系，沿用至今；20世纪后，饲料纯养分分析与仪器分析的发展。2、饲料质量分析方法方法：化学分析内容：概略养分；纯养分；养分的生物学效价第一章 饲料质量分析与检验概论物理分析分析内容：饲料及原料的质量和是否搀假第二节饲料样品的采集与制备饲料原料和配合饲料的变异(1)自然变异 (2)加工 (3)搀假 (4)损坏和变质样品的采集目的 ：是通过对样品的理化指标的分析，客观地反映受检饲料原料或产品的品质。样品的分析结果有不同的用途：(1)为饲料配方选择原料 (2)选择原料供应商 (3)接收或拒绝某种饲料原料 ()判断产品的质量是否符合规格要求和保证值。以决定产品出厂与否或仲裁买卖双方的争议(5)判断饲料加工程度和生产工艺控制质量。(6)分析保管贮存条件对原料和产品质量的影响程度。(7)保留每一批饲料原料或产品的样品，以备急需时用。()分析测定方法的准确性和实验室或人员之间操作误差的比较 。 结论：采样比分析更为重要 采样的要求 :(1)样品必须具有代表性 (2)必须采用正确的采样方法 采样要做到随机、客观，不同代表性的区域取样点，然后充分混合成为整个饲料的代表样品 。(3)样品必须有一定的数量 注意点:原料和饲料成品的水分、粒度和平行样的多少采样步骤:(1)采样前纪录 记录与原料或产品的生产厂家、生产日期：批号，种类，总量、包装堆积形式、运输情况、贮存条件和时间、破损、霉变等。(2)原始样品初级样品采集 原始样品一般不得少2kg(3)次级样品平均样品采集 平均样品一般不少于1 kg (4)分析样品实验样品 分析样品的数量根据分析指标和测定方法要求而定 采样基本方法：(1)几何法指把整个一堆物品看成一种具有规则的几何立体，如立方体、圆柱体等取样时首先把这个立体分成若干体积相等的部分，这些部分必须在全体中分布均匀，从这些部分中取出体积相等的样品，这些部分的样品称为支样，再把这些支样混合即得样品。 几何法常用于采集原始样品和大批量的原料 2四分法 是指将样品平铺在一张平坦而光滑的一张方形纸或塑料布等上(大小视样品的多少面定)，提起一角，使饲料流向对角，随即提起对角使其流回，如此法，将口角轮流反复提起，使饲料反复移动混合均匀，然后将饲料堆成等厚的正四方形体或圆锥，在饲料样品方体上划一十字，将样品分成4等份，任竟弃去对角的2份，将剩余的2份混合，继续按前述方法混合均匀，缩分，直至剩余样品数量与测定所需要的用量相接近时为止。 不同饲料样品的采集 :1散装2装袋 粉状饲料取样袋数不少于总袋数的3%，总袋数在100袋下，取样不少于10袋，每增加100袋需增加1袋，取样袋数至少为总袋数的10% 。3仓装 原始样品在饲料进入包装车间或成品库的流水线或传送带上，贮塔下、料斗下、秤上或工艺设备上采集 。 饲料库中的散状产品按高度分层采样，即采样前将层表面划分分为6个等份，在每一部分的正方形对角线的四角和交叉点5个不同地方采样。液体饲料 7桶以下，取样桶数不少于5桶。 10桶以下，取样桶数不少于7桶。 10一50桶取样桶数不少于10桶。 51100桶，取样桶数不少于)5桶。 101桶以上，按不少于总桶数的15取。固体油脂对在常温下呈固体的动物性油脂的采样，可参照固体饲料采样方法，但加热熔化棍匀后，才能采集次级样品。 黏性液体黏性浓稠饲料如糖蜜，可在卸料过程中采用抓取法 。 7块饼类 大块状饲料从不同的堆积部位选取不少于5大块，从每块中切取对角的小三角形块，捶碎混合后再用四分法取分析样品200g左右。 小块的饼粕，要选取具有代表性者数l0片，粉碎后充分混合用四分法取分析样品约200g左右。8 副食及酿造加工副产品 取样方法是：在贮藏池、木桶或贮堆中分上、中、下3层取样，每层取5l0个点，在60一65恒温干燥箱中干燥供制风干样品用 。9块根、块茎和瓜类10新鲜青绿饲料及水生饲料 第一章 饲料质量分析与检验概论11青贮饲料 原始样品质量为5001000g青贮壕和青贮窖的采样点视青贮壕长度和青贮窖深度大小分为若于段，每段设采样点分层取样。 第一章 饲料质量分析与检验概论3.样品的制备 样品的制备指将原始样品或次级样品经过一定的处理成为分析样品的过程. 样品制备方法:包括烘干、粉碎和混匀，制备成的样品可分为半干样品和风干样品。风干样品的制备风干饲料是指自然含水量在15%以下的饲料。1原始样品的采集 2次级样品的采集 3分析样品制备半干样品的制备 新鲜的青饲料、青贮饲料等测定饲料的初水含量后制成半干样品，以便保存，供其余指标分析备用 注意：登记样品名称、种类、规格型号、批号、产地、贮存条件、采样部位、采样人、采样日期、生产厂家、通讯地址等。4.样品的保管 用不与其发生反应的材料包装，外加布袋或牛皮纸袋，贴上标签及封条，加盖公章；为特殊目的需长期保存的可用锡铝纸软包装 经抽真空充氮后密封，冷库中保存第二章 饲料中一般成分的分析第一节 氨基酸的分析 氨基酸分析是指把以肽键结合的氨基酸残基构成的蛋白质经过加热水解，生成游离的氨基酸，再通过液相色谱等进行分析其氨基酸构成比例的种简单而有效的方法 .一.待测样品的前处理方法酸水解法 一般使用重蒸5.7molL盐酸(恒沸点盐酸)，在密封的水解管中，于105115水解20h以上。用盐酸水解后，得到的氨基酸不消旋，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸也有某种程度被破坏，对这些氨基酸的破坏率，需要用不同水解时间测定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为0时，算得的氨基酸含量，即代表了真正数值 ；碱水解法 碱水解法是盐酸水解法的互补法，碱水解时，可使多数氨基酸遭到破坏，仅色氨酸是稳定的，所以此法仅限于测定色氨酸的含量；磺酸水解法 为盐酸水解法的改进法，磺酸是非氧化性的强酸，此方法可以测定除半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸以外的所有氨基酸； 酶水解法 是用一组混合的蛋白酶水解肽链，可以保持所有的组成氨基酸不被破坏，缺点是水解不完全，另外，因为酶本身也是蛋白质，对样品的测定结果会有干扰。 二.氨基酸的定性与定量 一般采用纸层析法、薄层层析法、离子交换柱层析法等进行分析. 柱前衍生法、柱后衍生法 .三.高效液相色谱法(HPLC)的分析测定 反应原理:经过水解后的所有氨基酸，在室温下与6氨基喹啉N羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(6aminoqulnolylnhydroxysuccinimidycMrbai21&tc，AQC)很快发生衍生反应，生成稳定的荧光衍生物AQc氨基酸，它可以经WatcrsAccQTag分析柱分离氨基酸，用荧光检测器测定。仪器设备(1)分析天平：精确至0.1mg (2)恒温干燥箱。(3)浓缩器或旋转蒸发器。(4)PH计。(5)超声波水浴(6)涡旋发生器。(7)高效液相色谱仪。(8)AccQTag氨基酸分析柱。(9)微量移液管。(10)玻璃器皿：水解管、衍生试管、量筒、容量瓶刻度试管、移液管等。5流动相A溶液 称19.04g分析纯三水乙酸钠，加1L纯水溶解，用稀磷酸(1：1，：)调整pH至5.2，加1 m1 EDTA溶液(1 mgm1)。加0.1g叠氮化钠，加2.37mL三乙胺，用磷酸缓冲液调整PH至4.95,用0.45um滤膜过滤。使用超声脱气。 6流动相B溶液 经0.45um滤膜过滤的色谱纯乙氰与超纯水按3：2(V：V)比例配制。在超声水浴中脱气20秒。76mol盐酸水解液 将优级纯的盐酸与蒸馏水按照l：1；(V：V)比例混和均匀即可。8过甲酸溶液 88%甲酸与30%的过氧化氢按9:1(v:v)室温下放置1h后移至0下保存。9氢溴酸(40，分析纯)10从AQC试剂四。测定步骤1样品的前处理(1)分析样品的准备：待测饲料样品必须具有代表性。用于氨基酸分析的试样需经磨碎，通过100目筛孔。由于氨基酸在氧及碳水化合物存在下易被破坏(Maillard反应，赖氨酸碳水化物)，在粉碎样品时其温度应低于50。样品磨碎后，可增加其表面积。应在室温下放24小时，使其含水量恒定。样品用量：通常是用样品中氮的含量来计算适用于氨基酸分析的样品用量，样品中氮的含量决定分析样品的用量。样品用量(g)32mgN(CPXO.16X10) 。为使测定的各种氨基酸在标准曲线的线性范围内，应使供分析的氨基酸溶液的浓度与标准氨基酸溶液的浓度相近。 一般用于氨基酸分析的样品中应含有约32mg的氮。同时要测定样品的干物质含量，可由分析天平(精确至0.1mg)称量。 (2)过甲酸水解处理：在蛋白质酸水解过程中，常伴有(半)胱氨酸及蛋氨酸的损失，为避免这种损失，通常可用过甲酸氧化反应使(半)胱氨酸及蛋氨酸分别转变成半胱磺酸及甲硫氧砜，这两种化合物在酸水解中是稳定的，且易与其他氨基酸分离。待过氧化反应结束后，要去除过量的甲酸，可以将加入HBr时应在冰浴中，边搅动边小心加入，每隔5min加数滴。加几滴丁醇去除气泡，如样品很快澄清即可 样品的酸水解法在氧化与未氧化两种样品中分别加入一定量的盐酸煮沸回流水解小时未氧化的样品水解时要充氮气最后水解完成后要在多孔玻璃器上过滤得到分析液水解工作液的制备分析掖浓缩至干后加入氨基丁酸标准储备液 贮存备用衍生反应生成各种氨基酸衍生物5色谱条件及分离(梯度洗脱)(1)柱温：对于一般缸基酸分析为37，含硫氨基酸一般为47 。 (2)检测器：荧光检测器(激发波长245nm，发射波长39anm)或紫外检测器(波长254nm)。(3)通过不同的梯度洗脱进行氨基酸的分离：HP系统配置不同，所 用梯度表不同 五氨基酸的自动分析经典的氨基酸分析方法是采用离子交换层析来分离各种氨基酸，分离后的氨基酸与茚三酮进行柱后反应，然后定量测定，但茚三酮法灵敏度差、检测限较低，样品中氨基酸含量在 200 5pmol 时，即仅能在纳克（ ng ）水平上进行检测，当样品中氨基酸含量低于 00pmol 时，与柱前衍生法相比，分析的准确性要降低一个数量级，而且此法受到流动相速度低这一限制，分析速度相对较慢。.分离测定原理其强弱顺序为：碱性氨基酸芳香族氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸及羟基氨基酸。测定步骤采样除了纯蛋白等本身均匀的样品外，一般样品特别是均匀度差的样品，应有几毫克原始风干样品，使样品具有代表性。粉碎原始风干样品要先进行粗粉碎，棍匀后用四分法缩分取出约 5g, 再用高速离心磨细磨，使其颗粒全部能通过 80 日筛孔，应避免磨温过高对某些氨基酸的损失。磨好的样品混匀，装人样品瓶中，保存于干燥阴凉处。脂肪含量 高的样品脱脂。为便于换算和对比，在样品水解的同时，应测定样品的含水量和蛋白质含量。样品的水解处理盐酸水解法除色氨酸和胱氨酸以外的氨基酸测定样品的水解用此法。 原理：常规水解法是使饲料蛋白在 110 、浓度 （ HCL ) 为 6mol / l 盐酸溶液作用下，水解成单一氨基酸，再经离子交换色谱法分离，并以荀三酮做为个 柱后衍生测定。水解过程中色氨酸全部坏不能测定。胱氨酸和蛋氨酸部分被氧化，使测定结果偏低碱水解法分析色氨酸样品的水解用此法。 原理：由于酸水解对色氨酸有破坏作用，因此需采用碱水解法来测定色氨酸，但碱水解会破坏精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸及半胱氨酸等，故本法只限于测定色氨酸，色氨酸在碱性条件下很稳定。过甲酸氧化处理一盐酸水解结合法含硫氨基酸 （半）胱氨酸、蛋氨酸样品的水解用此法。 原理：由于在蛋白质酸水解过程中，常伴有（半）胱氨酸和蛋氨酸的损失，不易得到准确的结果。通常可用“过甲酸”氧化法预处理，使胱氨酸及蛋氨酸分别转变成半胱磺酸及甲硫氧砜，这两种化合物在水解过程中是稳定的，且易于与其他氨基酸分离。然后氰溴酸或偏重业硫酸钠终止反应，再进行普通的酸水解后，以荀三酮做柱后衍生剂，经离子交换色谱法分离测定。酶水解法对酸不稳定的样品，如天门冬酰胺、谷氨酰胺及色氨酸的水解用 此法。 原理与特点：天门冬酰胺、谷氨酰胺在酸水解时会分别生成天门冬氨酸、谷氨酸，测定的天门冬氨酸、谷氨酸应当是分别含有天门冬酰胺、谷氨酰胺的部分。要想了解天门冬酰胺、谷氨酰胺的数量时，通过酶水解法可以实现。催化蛋白质水解的效率高，极少的酶可以催化较多底物；水解蛋自质的酶有木瓜蛋白酶、脯氨酸肤酶、氨基肤酶、竣基肤酶、胰糜蛋白酶、胰蛋白酶及胃蛋白酶等酸提取法赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸等游离氨基酸的测定用此法。 测定原理：饲料中添加的游离氨基酸可以用稀盐酸溶液直接进行提取处理，然后经离子交换色谱分离，进行测定。分离洗脱经水解获得的氨基酸的洗脱是用不同 pH 的缓冲液来进行的，一般标准分析（蛋白质水解物）采用柠檬酸钠盐作缓冲溶液，如果分析生理体液（尿、血浆、（乳汁、脑脊髓液及植物组织提取液），则采用柠檬酸锂盐作缓冲溶液，因为天门冬酞胺及谷氨酞胺于钠盐缓冲液中，在图谱上不能与天门冬氨酸和谷氨酸分开，两者重叠成一个峰，不能得出各自的结果。标准分析（蛋白质水解分析）一般采用 4 种缓冲液：缓冲液 l 的 pH 为 3 . 3 ，可以冲洗出酸性氨基酸；缓冲液 2 的 pH 为 3 . 3 ，主要用于冲洗出中性氨基酸，缓冲液 3 的 pH 为 4 . 3 ，主要用于冲洗异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；缓冲液 4 的 pH 为 4 . 9 , 主要用于碱性氨基酸的洗脱。.分析结果洗脱出来的氨基酸，与另一通路的茚三酮溶液结合，在一定温度条件下，便呈颜色反应，一般氨基酸Ruheman 紫色，但脯氨酸呈黄色，所以氨基酸自动分析仪一般都设有两个频道：一个频道是 570 nm 波长，另一个频道为 440 nm 波一长。第二节脂肪酸的测定 测定饲料脂肪中的脂肪酸主要有两种情况：一种是总酸度的测定，可作为衡量饲料脂肪酸败程度的标志另一种情况是对个别重要脂肪酸的测定。例如，油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等具有重要生理作用，常作为重要营养物质加以测定，而芥酸等则作为有害物质加以测定。第二章 饲料中一般成分的分析(一)总酸度的测定1原理 用中性乙醇和乙醚混合溶剂溶解试样，以酚酞为指示剂，用氢氧化钾标准溶液滴定，最后以lOOg样品消耗.1molL氢氧化钾毫克数表示。2仪器设备(1)实验室用植物样品粉碎机成研钵。（2)分样筛：40目。（3)滴定管：25ml。（4)三角瓶：250m1。（5)天平：感量O.0001g（6)带玻璃塞锥形瓶。(7)容量瓶、移液瓶、称量瓶、试剂瓶3试剂(1)0.O1molL氢氧化钠95乙醇标准溶液(2)0.1酚酞乙醇溶液。(3)苯。4操作步骤(1)称重：准确称取10一20g样本(准确至0.001g)放入锥形瓶中，准确加入50mL苯，加塞振荡几秒钟后，松开瓶塞放出产生的苯蒸气再加振荡30分钟。 (2)滴定：待溶液静止澄清后，准确吸取20ml溶液转入250mL三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，立即用0.Olmo1L。氢氧化钠乙醇标准溶液滴定，直至溶浓呈粉红色并在0.5分钟内不褪色为终点。记录消耗的氢氧化钠乙醇标准溶液体积。同时作空白试验C: 碱标准溶液的摩尔浓度v1: 样品溶液总体积(mL) 2: 滴定时所取样品溶液体积(mL) W: 样品质量(g)56.1: 氢氧化钾的摩尔质量。 说明：取样后应即时进行测定，不宜久放，否则脂肪分解会使酸度上升提取脂肪酸所用的溶剂有水、乙醇乙醚(1：1)混合液、苯等青绿饲料中含低级脂肪酸(如苹果酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、琥珀酸等)较多，可用煮沸冷却后的蒸馏水提取 但高级脂肪酸不溶于水，而溶于有机溶剂，故谷物、油饼、动物性饲料的酸度测定则选择有机溶剂作提取剂而有机溶剂中乙醚挥发性较强且溶解能力稍差通常用苯较多。(二)脂肪酸的测定原理 脂肪酸具有一定挥发性，可用气相色谐法直接测定。但高级脂肪酸的沸点较高，高温气化不仅测定速度慢，而且一些不饱和脂肪酸易发生分解，故通常采用甲酯化，使之转变为低沸点衍生物后进行测定。常用的甲酯化方法有两种：一种是在甲醇溶液中，以B3为催化剂，使脂肪酸的羧基生成甲酯；另一种是在浓硫酸作用下，与甲醇反应生成甲酯 2仪器设备(1)实验室用样品粉碎机或研钵(2)分样筛:40日(3)分析天平：感量0.0018(4)气相色谱仪，具双氢焰检测器(5)色谱柱：直径0.4cm、 长2m的不锈钢管柱；硅烷化担体为chrmosorbW80100目，经酸洗和二氯二甲基硅烷处理；固定液为20一30聚乙二醇丁二酸酯(DEGS)或1015阿皮松(6)索式肪提取器及回流冷凝装置(7)KD浓缩器(8)恒温水浴(9)分液漏斗 3试剂 （）三氯化硼甲醇溶液：将10g三氧化硼乙醚溶液与100g无水甲醇混合而成。（）1碳酸钠溶液（）0.5molL氢氧化钾乙醇溶液（）石油醚：沸程30一60。（）乙醚。（）无水硅酸钠：200下烘1h，放干燥器中冷却，备用。（）脂肪酸甲酯或标样4操作步骤(1)色谱柱的制备：称取l00g左右的硅烷化担体，放入溶于丙酮或氯仿的20一30聚乙二醇丁二酸酯(DEGS)或lo15阿皮松L溶液中，搅拌使固定液均匀地涂于担体表面，倒出多余的溶液。担体放瓷盘中，置于通风橱中晾干。将色谱柱先用10氢氧化钠溶液、甲醇和苯分别清洗后，烘干。在色谱柱一端用玻璃棉塞住，抽气减压，小心装入涂好固定液的担体，并不时轻轻敲击柱子，使填充的担体均匀而紧密，装满后用玻璃棉塞住另一端柱口。将色谱柱接于仪器装置，于200柱温下，用测试时载气流量的一半老化36h。(2)样品溶液的制备：准确称取10g左右样品(准确至0.001g)。用脱脂滤纸包好，置于100150恒温箱中烘3h，取出放入索氏脂肪提取器中，用石油醚提取816h。提取完毕后，将提取液浓缩至10m左右，全部转入分液漏斗中，加10m1碳酸钠溶液，振动，游离脂肪酸即以钠盐形式进入水层，静置分层，分出水层于另一分液漏斗中，石油醚再用10ml碳酸钠溶液提取1次，合并两次提取液，用2mol。盐酸酸化至pH3(此时脂肪酸又游离而出)再用石油醚提取23次，每次用5m，合并石油醚于另一分液漏斗中，用水洗涤至 中性(pH试纸检查)分出水层，用2g无水硅酸钠燥，将石油醚转入50mL烧瓶中，在水浴上浓缩，即得游离脂肪酸。 (3)提取混合脂肪酸(游离肪酸和结合脂肪酸)：准确称取2g样品，按前述步骤用脂肪提取器提出脂类，然后在提取液中加入0.5molL氢氧化钠乙醇溶液20 m1，加热回流1h(8090)，蒸出大部分乙醇后，加水30mL稀释。用乙醚振摇提取2次，每次用量10m，以除去不皂化物。用稀酸酸化(pH3)，用乙醚提取脂肪23次，每次用量10m。合并乙醚层，用水洗涤至中性，加无水硅酸钠干燥。转入50m烧瓶中，在水浴上浓缩，即得混合脂肪酸。(4)甲酯化：在上述烧瓶中加入35m三氟化硼甲醇溶液，装上回流冷凝管，在80水浴上加热10min，取下冷却，转入100m分液漏斗中。烧瓶分别用15m饱和食盐水和10m石油醚冲洗，冲洗液并入分液漏斗中。振摇5min，弃去水层，再用10m饱和食盐水洗涤1次，弃去水层。将石油醚用无水硅酸钠干燥后，放入KD浓缩器中，分液漏斗用5ml石油醚冲洗2次，洗后的石油醚也放入浓缩器中，减压浓缩至一定体积。测定时的色谱条件为柱温从150开始，以68min程序升温至180200 检测器温度为250 ，气化室温度为250 氮气流速20mlmin，氢气流速40mLmin，空气流速40mLmin。(5)样品测定：用微量注射器准确吸取210ul(含各种脂肪酸10一50ug)样品溶液，注入基线稳定的气相色谱仪中，按上述色谱条件测得各组分色谱图和保留时间，再准确吸取一定体积的标样溶液或混合标准溶液。测定测量标祥和样品溶液各组分的峰面积并求得质量校正因子X-肪酸含量(R)； Ai -被测组分的峰面积；As-内标组分的峰面积； s-内标溶液中内标物质量Wm-样品质量(e)；F被测组分的校正值各组分的质量校正因子：乳酸16，草酸605富马酸26。丁二酸106，戊二酸软脂酸257油酸2亚油酸6 72，亚麻酸709。 各种脂肪酸在色谱图中的出峰顺序按碳原子数的增加顺序排列，当破原了数相等时则随不饱和度的增加而推延。第三章 饲料中矿物质微量元素分析第一节 有机物的破坏方法(样品的预处理)一.干灰化法（Dry ashing）简称灰化法或灼烧法，是一种常用的有机物质破坏法，适用于除汞、砷以外的各种金属类金属元素。1.直接灰化法：将样品放在坩埚中，在高温灼烧下，使样品脱水、焦化，在空气中氧的作用下，使样品中的有机物氧化分解成二氧化碳、水和其它气体而挥发，剩下无机物（盐类或氧化物），用适当溶剂溶解定容，供测定用。 加助灰化剂灰化法：常用的助灰化剂有氧化镁、硝酸镁、氢氧化钠、氢氧化钙等。加入助灰化剂，可使样品呈疏松状态，加速灰化过程，并使灰化完全。 助灰化剂还可和被测物质结合成难挥发的盐类，防止灰化过程中被测物质的损失，如氧化镁或硝酸镁能使砷变成难挥发的焦砷酸镁（Mg2As2O7），氢氧化钙则转变成难挥发的CaF2等。干式灰化法的优点 其它试剂少，减少了操作过程污染的可能性，因而空白值低；样品分解彻底，操作简便，仪器设备简单，一次可以处理大的样品。缺点： 干灰费时，一般500550需4 hr，600需1hr2hr； 长时间的高温加热易使一些被测物质挥发； 瓷坩埚能吸附金属，可造成结果偏低。干灰化法操作的注意事项 灰化前应进行样品的预炭化，预炭化系指将坩埚内的样品先放在文火上加热，直至样品变黑，然后转入控温茂福炉内550灰化，预炭化的目的在于防止样品因急剧灼烧引起的残灰飞散。 瓷坩埚对金属有吸附作用，特别是新的瓷坩埚，因此在使用时应选用用过的坩埚。 如果样品在灰化后仍不变白，可在冷却后沿坩埚边缘加入少量蒸馏水湿润，再使其充分干燥后继续灰化。加水的目的是有助于灰分溶解，解除低熔点灰分对炭粒的包裹。 2、湿灰化法（Wet digestions）简称消化法，也是常用的样品无机化方法之一。系利用氧化性强酸，结合加热将有机物质破坏使待测的无机物分解释放出来并形成难挥发的无机化合物供测定用。它适用于易挥发散失的矿物质，除汞外，大多数金属均有良好效果。（1）常用的氧化性强酸在消化过程中常用的氧化性强酸有浓硝酸、浓硫酸和高氯酸三种。 浓硝酸 通常使用的浓硝酸，其浓度为6568%（ml/ml），有较强的氧化性，浓HNO3在温热条件下分解成O2、NO2和H2O，NO2进一步分解成O2及NO。沸点较低，硝酸易挥发，因而需要经常放冷补充，消化完成后消化液中常含有较多氮氧化物，必要时需加热或加水加热除去。 高氯酸 冷的高氯酸无氧化能力，但热的高氯酸却是一种极强的氧化剂，氧化能力强于硝酸和硫酸。这是由于高氯酸在加热条件下能产生氧和氯的缘故。4HClO4 7O2+2Cl2+H2O应予注意的是，HClO4在高温下直接接触还原性较强的物质如酒精、脂肪、糖类、甘油等有发生爆炸的可能，故一般不单独使用，并且勿使消化液烧干，以免发生危险。 硫酸 热的浓硫酸具有一定的氧化作用。受热分解时，放出氧、二氧化硫和水。H2SO4 O2+SO2+H2O硫酸较硝酸、高氯酸弱得多，但硫酸沸点高，不易挥发。（2）常用的消化方法在实际工作中，除了单独使用浓硫酸的消化法外，经常采取两或两种以上氧化性强酸配合使用，利用各种酸的特点，取长补短，以达到安全快速、完全破坏有机物的目的。 硝酸-硫酸湿消化法将5g样品置于100ml的凯氏烧瓶中，随之加入与浓硝酸等体积的蒸馏水，缓缓加热至沸腾，继续加热至容积减半。冷却后逐渐加入10ml硫酸，再加热，待内容物变黑，既加入少量浓硝酸，为防止过度炭化，加热必须适度，整个消化过程必须存在少量的硝酸，加热至发烟而不再变黑，最后至溶液无色，冷却、用蒸馏水稀释至一定体积备用。本法可缩短炭化过程，减少消化时间，反应速度适中。但因消化过程中使用硫酸，而碱土金属的硫酸盐溶解度较小，故本法不宜作碱土金属的分析。 硝酸-高氯酸湿消化法 将含有不超过2g干物质的样品至于200ml的凯氏烧瓶中，加入25ml硝酸（相对密度为1.42）缓慢蒸煮沸30min，冷却、加15ml高氯酸（60%w/w）。缓慢煮沸至无色或近乎无色，继续沸腾1hr（注意防止瓶中内容物蒸干）。冷却，用蒸馏水稀释至适当体积备用。 本法氧化能力强，反映速度快，炭化过程不明显；消化温度较低，挥发损失少。但由于硝酸和高氯酸加热后均容易挥发，故如温度过高、加热时间过长，容易烧干，并可能引起残余物燃烧或爆炸。本法对某些还原性较强的样品，如酒精、甘油、油脂和大量磷酸盐存在时，不宜采用。 湿消化法的特点 优点：所用时间短，温度较低，因而挥发损失较少，同时应用玻璃仪器（凯氏烧瓶），吸附损失也较少。 缺点：使用试剂较多，易造成高的试剂空白值，操作较复杂，危险性大，不便于大量样品的处理。为此，美国分析化学家协会（AOAC）推荐一种湿消化法和干灰化法相结合的消化方法，其过程如下： 1g样品置于上釉的高形陶瓷坩埚内，500灰化2hr，冷却，用10滴蒸馏水湿润，然后小心加入34ml硝酸（1:1），100200下蒸发除去多余的硝酸，将坩埚转至马福炉内，500灰化1hr，冷却、用100ml盐酸（1:1）溶解并定量转至 50ml的容量瓶中定容。 湿消化法的注意事项 消化所用试剂要纯，同时必须做空白试验，以扣除消化试剂对测定数据的影响。 样品中加入硫酸、硝酸后应先用文火加热，以防反应过于剧烈而产生大量泡沫，待反应平稳后方可加大火力，但整个消化过程的温度仍应严格控制，以防溶液溅出或消化不完全。 消化过程中一定要保证瓶中有少量的液体，以防发生危险。在补充氧化剂时要先停止加热，并稍微放冷后，然后沿瓶壁缓缓加入，以防反应过于剧烈而造成喷溅。第二节 原子吸收光谱分析一.原子吸收光谱分析法，简称 AAS ，是基于光源（空心阴极灯）辐射出具有待测元素特征谱线的光波，当通过试样所产生的原子蒸汽时，被蒸汽中待测元素的基态原子所吸收，根据辐射光强度减弱的程度，即可求出试样中待测元素的含量。在一定的实验条件下，试样的吸光度与其中待测元素的含星之间服从朗伯一比尔定律。因此，只需测定试样溶液的吸光度和相应标准溶液的吸光度，即可根据标准溶液的浓度计算出试样中待测元素的含量。这就是原子吸收光谱分析法定量测定的基本原理。二. 仪器的组成及其主要作用 原子吸收光谱分析仪主要由光源、原子化系统、分光系统、测光系统、数据处理系统和显示系统五大部分组成( l ）光源。包括元素灯（空心阴极灯）和灯电源两个部分，其作用是为仪器的光学系统提供一个输出稳定、发射强度大、具有特定波长和谱线宽度窄的锐线光潜。 ( 2 ）原子化系统。使待测试样在仪器中变为基态原子的装置，其作用是保证空心阴极灯发射的待测元素特征谱线，能被试样中相应元素的基态原子充分而有效地吸收。包括火焰原子化器和无火焰原子化器两种.( 3 ）分光系统。由衍射光栅（或色散棱镜）和反射镜等组成。其主要作用是将透过原子化系统的复合光，经过衍射光栅的色散作用，展开成按照波长顺序排列的单色光，并通过扫描机构把待测元素的原子吸收信号送人光电倍增管进行检测。 ( 4 ）测光系统。包括光电倍增管、负高压电源和放大器等部件，其作用是将从分光系统传送过来的原子吸收信号接收下来，转换成光电流并经过放大器放大后输出。 ( 5 ）显示系统。主要包括数据处理、显示器和打印机，其作用是将测光系统输出的电信号显示或记录下来，也可以根据特定的数学公式进行计算和处理，并把处理结果用一定的方式显示和打印出来。三. 定量测定方法 原子吸收光谱法的常用测定方法包括标准曲线法、直接比较法、紧密内插法和标准加人法等，其从本原理都是利用朗伯一比尔定律，由已知浓度的标准溶液求得待测试样溶液的浓度。 1.标准曲线法 仪器工作条件。测定波长： 357 . 9 nm ；灯电流： 3 mA ；电压： 370 - 38oV ；燃烧器高度： 0 . 7 cm ；空气流量： 320L h 一1；乙炔流量： 60L h -1；提升量： 8 mL min-1。 实验步骤 a 试样分解液的制备：准确称取饲料或粪样约 1g，精确至 0.0001g ，置于 30ml ，瓷柑祸中，在电炉上小火加热炭化，待无烟后移至高温炉中，在 550 一 600 下灰化 3h ；或称取试样约 5g，置于 100 mL 硬质、高型烧杯中进行湿式消化。待冷却后，加入5mL 浓硝酸和 l-2mL 浓盐酸，盖上坩埚盖或表面皿，在电砂盘上加热消化，至残渣变为无黑色炭粒为止，再加热至溶液约为 1 ml ，。冷却后，加人 3-5 ml蒸馏水，加热至近沸，过滤于 25 ml ，容从瓶中，重复淋洗残渣 3 一 5 次，滤液一并回收人容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度。取上清液在原子吸收光谱仪上测定铬的含量。第三节 汞的测定 冷原子吸收分光光度法 1.原理 样品经硫酸硝酸消化，使汞转变成离子状态，在强酸性溶液中以氯化亚锡（SnCl2）将汞离子还原成元素汞，以氮气或干燥清洁空气作载体将汞吹出，于253.7nm波长处进行原子吸收测定，与标准系列比较定量。2.特点 具有较高的灵敏度，干扰少和操作简便等特点，是国家标准法，适合于汞含量低于1mg/kg的饲料样品测定。 双硫腙比色法双硫腙比色法是经典法，干扰因素多，需分离或掩蔽干扰离子，操作较繁，需严格操作才能得到满意结果，适用于测定含汞量高于1mg/kg的饲料样品。1、原理 样品经消化后，汞离子在酸性溶液中与双硫腙作用生成橙色色络合物，经氯仿萃取后，于490nm波长下与标准系列比色定量。3、试剂 硝酸。 硫酸。 氨水。 三氯甲烷：不应含有氧化物。 1N硫酸 量取5ml硫酸，缓缓倒入150ml水中，冷后加水至180ml. 5%liusuan 量取5ml硫酸，缓缓倒入90ml水中，冷后加水至98ml。 麝香草酚蓝指示剂 0.1%乙醇溶液。 20%盐酸羟胺溶液 0.05%三氯甲烷溶液为双硫腙溶液：保存于冰箱中。 双硫腙使用液：吸取1.0ml0.05%双硫腙三氯甲烷溶液，加三氯甲烷至10ml，混匀。用1cm比色皿，以三氯甲烷作参比，于波长510nm下测吸光度，用下式算出配制100ml双硫腙使用液（透光率）所需0.05%双硫腙三氯甲烷溶液的ml数（）。然后取ml0.05%双硫腙三氯甲烷溶液用三氯甲烷稀释至100ml。 汞标准溶液 精确称取0.1354g经干燥过的二氯化汞，加1N硫酸溶解后，移入100ml容量瓶中，并水稀释至刻度。此溶液每1ml相当于1mg汞。 汞标准使用液 吸取1.0ml汞标准溶液，置于100ml容量瓶中,加1N硫酸稀释至刻度。此溶液每毫升相当于10mg。再吸取此液5.0ml于50ml容量瓶中,加1N硫酸稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1mg。、操作方法 将消化液在电炉上煮沸10min，除去二氧化氮等，放冷。向消化液及试剂空白加5%高锰酸钾溶液至溶液呈紫色，然后再加、1ml20%盐酸羟胺溶液使紫色褪去，加2滴麝香草酚蓝指示剂，用氨水调节pH，使橙红色变为橙黄色（pH1-2）。定量移入分液漏斗中。 吸取汞标准使用液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml（相当于0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg铅），分别置于125ml分液漏斗中，各加10 ml5%硫酸，加水至40ml，混匀。再各加1ml20%盐酸羟胺，放置20min。%硝酸溶液至20ml。于样品、试剂空白和标准液的分液漏斗中加5.0ml双硫腙使用液，剧烈振摇2分钟，静置分层后，三氯甲烷层经脱脂棉滤入1cm比色杯中，以三氯甲烷作参比，于波长490nm测吸光度，以标准管吸光度减去零管吸光度，绘制工作曲线。根据样品和试剂空白的吸光度，在工作曲线上求出其含量。5、结果计算M汞（mg/Kg） =式中：A1样品消化液中汞的含量，ug； A0试剂空白液中汞的含量，mg； m样品质量，g；第四章 饲料中维生素的测定第一节 脂溶性维生素的分析测定 目前，已被确定的维生素有 14 种，按其溶解性将其分为脂溶性维生素和水溶性维生索两大类。脂溶性维生素包括维生素 A 、维生素 D 、维生素 E 、维生素 K ，水溶性维生素包括维生素 Bl 、维生素 B ：、维生素饯、维生素 Bl ：、烟酸、泛酸、叶酸、维生素 C 、生物素、胆碱。同一种维生素可能有多种不同的化学结构，他们在动物体内表现出不同的生物活性，有些维生素作为饲料添加剂使用的维生素制剂，由于其主要维生素形式不稳定，常用其稳定的化合物形式，如维生素 A 的商品制剂就有维生素 A 乙酸酯和维生素 A 棕榈酸酯。 一.目前测定维生素的方法主要有： 物理化学法； 微生物法； 生物化学法。其中，以物理化学分析法应用最广，它包括分光光度法、荧光分析法、薄层层析法、电化学分析法、气相色谱法、液相色谱法。 二.维生素的采样与制样 维生素在一般饲料样品中含虽较低，且分布不均匀，故采样量较大。对于一些个体较大的样品，如红薯、萝卜、胡萝卜以及一些瓜类饲料，更应重视其采样方法。这些样品的向阳和背阴部位的维生素含量有较大差异，可将其纵向切成 8 等份，然后从各份中纵向切取 l 片混合，或从中心轴线成 450 横切面上切取 1 片混合，然后切碎缩分。对于叶片较大的牧草、野菜、藻类等，采样时一定应注意其光照方向及叶丛明暗，使之有代表性。三、饲料添加剂维生素 A 的测定 1.适用范围本方法适用于合成维生素 A 乙酸酯，加人适量抗氧化剂，采用明胶为主要辅料制成的微粒。 2.原理维生素 A 乙酸酯经皂化转化为游离的维生素 A ，用有机溶剂提取后进行 HPLC 分离，外标法测定维生素 A 含最。 3.仪器设备 超声波恒温水浴。 高速离心机。 高效液相色谱仪。 4.试剂和溶液 无水乙醇。 全反式维生素 A 乙酸酯对照品。 碱性蛋白酶（酶活力每克大于 40 000 单位）。0.1 %氨水溶液。 乙氰：色谱纯。重蒸馏水（液相色谱专用）。5.测定方法 ( l ）对照品溶液的制备：称取约 85 一 90mg （准确至 0.0001g ）全反式维生素 A 乙酸醋对照品，置于 50ml 棕色容量瓶中，加人 30 一 40ml 无水乙醇，置于超声波水浴中处理 2min 使之完全溶解，用无水乙醇稀释到刻度，摇匀。精密吸取此溶液 10.00ml 于 100ml 棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀待测。第四章 饲料中维生素的测定( 2 ）试样溶液的制备：精确称取试样约 0.29 （准确至 0 . 0001g) ，置于 200ml棕色容量瓶中，加人 200mg 的碱性蛋白酶，0.1 氨水溶液 10ml ；将容量瓶置于 45 超声波水浴中处理 10min ，加人 l00ml 无水乙醇后猛烈振摇，然后用无水乙醇稀释到刻度，摇匀。将混合液离心后，取上清液，经。0.2um 微孔滤膜过滤后用于高效液相色谱的测定。 ( 3 ）高效液相色谱仪条件：色谱柱：不锈钢色谱柱， 长 250mm ，内径 4.6mm ; 固定相： ODS 一 2 , 5 um ; 流动相：乙睛:异丙醉，水= 1 500:250:25 。流速： 1.0ml / min ; 进样量： 10ul ; 检测波长： 326nm 。一、饲料添加剂维生素 B 1的测定 1.适用范围 本方法适用于化学合成法制得的维生索 B1 , （盐酸硫胺或硝酸硫胺），在饲料工业，作为维生素类饲料添加剂。 2.原理 盐酸硫胺（硝酸硫胺）在酸性条件下与硅钨酸形成盐酸硫胺硅钨酸盐（硝酸硫胺硅钨酸盐）沉淀，由生成的沉淀量计算维生素 Bl 含量。 3.仪器设备 一般实验室仪器设备。4.试剂与溶液 盐酸。 硅钨酸： 10溶液。盐酸：取盐酸 5ml ，加水稀释至 100ml 。丙酮。第五章 饲料中有毒有害物质的分析第一节 农药的分析测定 自20世纪40年代以来，随着科技的进步和生产的不断发展，人工合成的农药品种日益增多。目前，全世界农药有1200余种，常用的约有250种。这些农药的应用，在农业、畜牧业及公共卫生等各方面都起到了积极的作用。但随着农药的长期和大量使用，环境和饲料的农药污染日益严重，并通过生物富集和食物链，可造成在动物体内蓄积而引起在畜禽产品中残留。 一.农药种类 1.有机氯农药 我国已于1983年停止生产、1984年停止使用有机氯农药。常用的有机氯农药有DDT、六六六、艾氏剂、氯丹、毒杀芬等。 2.有机磷农药 有机磷农药是始创于20世纪30年代，在二次大战后广泛地用于农业上，是我国目前使用最广泛的杀虫剂 .常用的有机磷农药有对硫磷（1605）、乐果、敌百虫、敌敌畏、和稻瘟净等。3.有机汞农药 70年代后，世界各国都已禁止或限制使用。1979年根据生产的实际情况，对有机汞农药的使用问题重新加以考虑并作了新的规定，不再全面禁用，可限制使用。主要品种有西力生（氯化乙基汞）、富民隆（磺胺苯汞）等， 4.有机砷农药 有机硫农药是近年来发展起来的一种新型杀菌剂，正在替代汞制剂等在农业生产上起着重要作用。常用的有机硫农药有代森类（如代森锌、代森铵）和福美类（如福美锌、福美铁等）。 5.有机氟农药有机氟农药的主要品种有氟乙酰胺、氟乙酸钠。 6.有机硫农药这类农药为一类主要用于防治水稻纹枯病的杀菌剂，属中等毒或低毒类。常用的品种有稻脚青、退菌特、甲基硫砷、稻宁等。二.有机氯农药的分析1.理化性质多数有机氯农药对光、热、酸稳定，如DDT 115200加热15h不发生分解，遇碱易失效。有机氯农药属脂溶性化合物，不溶于水，而易溶于多种有机溶剂，如苯、二甲苯、氯仿、正已烷、石油醚等。2.提取最常用的提取方法为振荡提取法和组织提取法。 对含水量低的谷物、饲料，可用正已烷或石油醚直接提取。 对含水量高的蔬菜、牧草等，应先以亲水性溶剂丙酮或乙腈进行提取，然后加硫酸钠溶液稀释，再以正已烷或石油醚萃取有机氯农药，以便纯化和浓缩。加硫酸钠溶液的目的是增大丙酮或乙腈液的极性，降低农药在它们中的溶解度，使其更完全地转移到正已烷或石油醚中，而水溶性杂质则留在丙酮层或乙腈层弃去。3.纯化和浓缩由于多数有机氯农药对酸都极为稳定，所以可用磺化法纯化。其操作方法是于100ml提取液中加10ml（即提取液的1/10）的浓硫酸，振摇1min后，静置分层，弃去下层水溶液，上层溶液由分液漏斗上口倒置另一250ml分液漏斗中，用少许石油醚洗原分液漏斗后，并入250ml分液漏斗中，加入100m l 2%硫酸溶液振摇后，静置分层，弃去下层水溶液，用滤纸吸干分液漏斗颈外的水。加硫酸钠溶液的目的是洗去沾附的硫酸，否则在样液浓缩后出现蓝色或黑色，从而影响结果。 将石油醚经盛有约15g无水硫酸钠的漏斗过滤，并以少许石油醚洗涤盛有无水硫酸钠的漏斗数次，洗液并入滤液中，然后用减压浓缩至1ml，供TLC用。 四.测定方法 有机氯农药定量分析的常用方法有GC和TLC法。 吸附剂 有机氯农药薄层定量的吸附剂有硅胶G和氧化铝G，其中氧化铝薄层色谱的灵敏度较硅胶略高。 制备薄层时加入少量硝酸银溶液，可提高测量的灵敏度，更有效地对复杂混合物进行分离。薄层板制备 称取氧化铝G45g加1ml1%硝酸银和6ml水，研磨成糊状，立即涂布于3块薄层板（520cm）上，厚度为0.25mm，于100活化0.5h，置干燥器中，避光保存。 展开剂 正已烷丙酮（991）、石油醚丙酮（991） 显色剂 有机氯农药的显色剂有两类： 硝酸银显色液 是有机氯农药最常用的显色剂，其灵敏度较高，最低检出量可达到0.01mg，并且显色斑点稳定。硝酸银显色液配制方法：称取硝酸银0.05g溶于数滴水中，加苯氧乙醇10ml，用丙酮稀释至100ml，加30%过氧化氢溶液10ml，混合后贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。硝酸银的作用是与有机氯农药中的氯在紫外光照射下生成氯化银，并进一步分解成氧化银的少量单质银的混合物，而显黑色斑点。mAgClAgCl2AgClnAgCl2+Ag+