一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪的研制.doc

第30卷 第10期 仪 器 仪 表 学 报 Vol.30 No. 102009年10月 Chinese Journal of Scientific Instrument Oct. 2009一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪的研制赵友全1，杨成文1，陈峰2，肖松山1(1 天津大学精密仪器与光电子工程学院天津300072；2 国家生物防护装备工程技术中心天津300161)摘要：甲霜灵胶体金试纸条用于现场快速检测进出口蔬菜甲霜灵农药残留量。在对试纸条光谱测量分析的基础上，研制出一种基于图像测量的便携式甲霜灵试纸条显色分析仪器，该仪器集成了样品滴定、定时检测、显色度分析、身份认证等多种功能，实现了试纸条的自动检测、显色度数值分析和数据存储。实验测定了浓度为250 ng/mL的标准浓度甲霜灵农药滴定的试纸条，结果表明，浓度40 ng/mL时，显色度差异不明显。关键词：农药残留；胶体金试纸条；显色度；光谱分析中图分类号：TP216.3文献标识码：A国家标准学科分类代码：520.6040Development of a novel portable color analytical reader forcolloidal metalaxyl gold test stripsZhao Youquan1, Yang Chengwen1, Chen Feng2, Xiao Songshan1(1 College of Precision Instrument and Opto-electronics Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China；2 National Bio-Protection Engineering Center, Tianjin 300161, China)Abstract：At present, one kind of colloidal gold strip is intensively applied to rapidly detect the metalaxyl pesticide residues. Based on the measured spectral property of the colloidal gold strips, this paper presents a novel portable color analytical reader, which integrates sample titration, regular timer, coloration analysis and model identification into one instrument; it can achieve automatic reading the strips, analyzing color value and saving data. Moreover, some practical metalaxyl dipstick tests had been carried out with a given concentration range from 250 ng/mL, the results indicate that the strip color is linear with the concentration when the titration solution is less than 40 ng/mL, but it has no much difference when it is greater than 40 ng/mL.Key words：pesticide residue; colloidal gold strip; color analysis; spectral analysis第10期 赵友全 等：一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪的研究 21771引言收稿日期：2009-02Received Date：2009-02甲霜灵是一种广泛应用于蔬菜、瓜类、水果等作物的病害防治的广谱杀菌剂，具有内吸附性强、残效期长的特点，进出口果蔬中常能检测出甲霜灵残留。世界各国对甲霜灵的残留量都有明确的规定1。目前国内普遍采用色谱法来测定甲霜灵残留量2，此类方法只局限于实验室环境，而且所需仪器设备复杂，样品处理程序繁琐，不适合对大量样品快速筛选。胶体金检测技术是一种低成本、方便快捷、灵敏高效、稳定性强的快速检测技术，广泛应用于食品药品、水质、生化防护、医疗卫生领域3。甲霜灵胶体金试纸条结合免疫反应技术和胶体金检测技术4，采用竞争法进行检测，可快速检测果蔬中甲霜灵残留情况。甲霜灵胶体金试纸条通过试纸条上测试线的颜色变化直观显示检测结果5：胶体金标记物随着溶液流向测试线，若样品液中无甲霜灵，胶体金标记物与测试线上蛋白特异性结合形成线条，标记为阴性；若样品液中存在甲霜灵，则与测试线上甲霜灵抗体结合，使得金标记物不能和测试线上物质结合，不显色，标记为阳性。通过对比标准比色卡，目测即可得到定性检测结果。目测判读方法，在长期的应用中暴露出很多问题：1)检测人应具备一定专业知识。当照明条件不好，或者有大量试纸条需要判读时，易产生人为误差；2)当待检测物质处于临界浓度范围内时，试纸条测试线显色浅而且不规则，难以目测判读；3)目测判读得到的是定性结果，检测人员的主观性可能影响结果判定；4)缺乏电子数据记录。研制一种具备信息检测、信息处理、信息记忆、逻辑思维与判断功能的智能化胶体金试纸条分析仪替代人眼目测显色结果变得尤为必要。国内外已开始试纸条检测仪的相关研究，采用光纤或者线阵CCD光电传感器，检测仪机械结构复杂，局限于室内应用。本文采用面阵CMOS图像传感芯片研制基于图像测量的胶体金试纸条检测器。系统集成样品滴定、定时检测、显色度分析、身份认证等多种功能，实现了试纸条的自动检测、显色度数值分析和数据存储。配备甲霜灵胶体金试纸条，可对进出口蔬菜中甲霜灵农药残留进行现场快速分析检测。2胶体金试纸条显色和检测原理胶体金试纸条应用的金纳米颗粒大小在20 nm至120 nm之间，此大小金颗粒能有效地反射可见光，对绿光效果最理想8。本文设计胶体金试纸条显色分析仪检测对象是胶体金试纸条。由吸光原理知，颜色深浅与光吸收和反射程度有关，颜色越浅，吸收光强越小，反射光强越大。当试纸条测试线上抗体或抗原与甲霜灵匹配时，测试线显色浅；当抗体或抗原不匹配时，测试线显色深，因此试纸条显色深浅反应甲霜灵溶液浓度信息。如图1所示，试纸条被划分为控制线搜索区（虚线范围），参照背景区和测试线，剩余均为背景区。控制线处于控制线搜寻区内，不同试纸条，控制线位置可能不同，必须动态搜寻来确定控制线在搜寻区的确切位置。控制线、参照背景区、测试线三者中心距离恒定不变，因此，控制线位置确定后，即可计算出参照背景区和测试线位置。测量过程中，镜头与试纸条距离，图像传感芯片成像参数不变，参照背景区和两条线在图像上成像大小基本不变，因此得到控制线后，即可推算出参照背景区和测试线显色特征。图1胶体金试纸条结构Fig.1 Colloidal gold test strip structure3基于视觉测量的检测系统3.1系统组成和功能胶体金试纸条显色分析仪系统组成如图2所示，组成模块有：主控制器、电源管理、恒流源控制、CMOS图像采集模块、热敏打印机、实时时钟、RFID射频模块、LCD显示、按键、Flash存储器等，研制得到样机见图3。图2分析仪器系统框图Fig.2 System block diagram图3试纸条分析仪实物图Fig.3 The utility of the strip reader本文研制的便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪具有以下特点：单个LED电源照明，简化硬件设计；面阵CMOS图像传感芯片采集试纸条图像，省略线阵器件的机械扫描结构，硬件设计简单，采集图像所需时间短；系统中添加RFID射频模块，当试纸条中嵌入IC存储卡时，通过RFID读写模块可实时读取试纸条相关信息，如：生产日期、检测物质类型等。胶体金显色为动态过程，超过一定时间范围显色结果无意义，写入IC卡的检测结果具有长期存档作用；系统为便携式手持仪器，热敏打印机集成于系统内部；优化电源管理模块：电池和交流适配器双通道供电切换，可自动进入省电模式，切断所有外设供电，主控制器进入休眠状态；主控制器选用美国硅实验室公司生产C8051F120高速芯片，芯片内核兼容标准8051内核，最高主频达90 kHz，峰值性能能够达到100 MIPS，能满足大量图像数据传输与分析处理工作。3.2照明光源发射光强空间不均匀度影响与去除图像采集子系统是甲霜灵胶体金显色分析仪的关键部分，原始图像数据的获取决定着整个系统分析结果的准确性。系统中CMOS摄像头处于像场的正上方，LED光源处于边缘，LED光源倾斜照明整个视场，试纸条上入射光强与试纸条到LED光源的距离有关，距离越远，入射光强越弱。入射光强存在空间不均匀度，采集得到图像光强也是不均匀的。胶体金试纸条显色分析仪中设计了专用试纸条限位匣，胶体金试纸条在图像采集系统中的位置固定，而且不同试纸条在匣中位置基本一致，已知LED光源光强随时间变化可忽略，不同试纸条背景光强在空间上分布是一致的。因此可利用标准图像与检测图像光强时间分布相似性，来校准检测图像背景空间的不均匀性。算法原理是采集空白条图像，作为参考图像G，统计参考图像典型特征，如强度最值Mmax，计算参考图像每个像素点系数，得到系数矩阵，保存到系统内存中。检测时，先利用系数矩阵对试纸条显色图像P进行修正，来校正图像P空间不均匀性，见式(1): (1)3.3图像预处理图像系统采集试纸条图像主要存在加性高斯噪声和随机噪声以及高频噪声。图像处理过程中，采集多幅连续图像求均值来抑制高斯噪声，提高信噪比；利用33小平滑模板对图像进行多次线性滤波，来抑制随机噪声和高频噪声。3.4控制线、测试线的识别和试纸条显色度分析由于生产和摆位误差影响，控制线在控制线搜寻区内位置不定，图像识别过程中必须采用算法动态搜控制线位置，然后推算背景参考区和测试线的位置。甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪系统工作以及图像处理流程图见图4。图4系统工作流程图Fig.4 System flow chart3.4.1控制线识别与显色特征控制线在控制线搜寻区中位置不固定，在图像处理过程中动态搜寻控制线的位置。为了减少图像处理数据量，首先对控制线位置粗略定位，然后采用模板匹配算法精确匹配控制线，识别出控制线。第1步：控制线定位。算法原理是：在控制条搜寻区（图1中虚线框区域）内，对每一行像素点灰度值求和得到行总和S，以行序号为轴，得到行总和S分布，见图5（逆时针旋转90）。已知控制线显色灰度值比周围背景区灰度值小，图像中点P1、P2之间波谷标定为控制线中心的可能区域。图5行灰度总和S分布Fig.5 Control line sum function S第2步：控制线精确匹配。选取与控制线大小相同模板M。假设模板长L，宽W，点(j,i)为模板中心点，见式（2）。V表示以点(j,i)为中心点的理论控制线的显色强度值，见式（3）。在P1、P2决定子区域中，V最小值的中心坐标点Pc，即为控制线实际中心点，V最小值记为Gc，表示控制线显色强度值。 (2) (3)3.4.2参照背景区和测试线中心位置已知控制线，参照背景区，测试线三者中心距离恒定不变，Pc为控制线中心，参照背景区中心Pr，测试线中心Pt，由式（4）计算得到。参照背景区在图像上成像大小基本不变，以Pr中心点参照背景区所有像素点求均值Gr为参照背景强度。, (4)3.4.3测试线显色特征以及显色度定义测试线是甲霜灵与胶体金标记物发生生化反应的区域，测试线是否显色，显色深浅反应出带检测溶液中甲第10期 赵友全 等：一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪的研究 2179霜灵含量。对测试线的准确识别是整个分析仪的核心，决定了分析仪准确性。当甲霜灵处于临界浓度值范围是，测试线显色不规则而且较浅，不易与背景区分开。在测量中，通过综合测试线全局强度和局部强度信息来准确识别测试线，避免漏检。全局强度G1为测试线内所有点灰度均值。局部强度G2计算。将测试线划分为大小相同N个子域，Gi表示第i个子域内所有像素点强度均值。设定阈值T，通过多次实验确定最佳值。N个子域中，强度均值Gi小于阈值T的子区域集和N1，表示发生显色反应区域，n表示发生显色反应子区域个数，剩余子区域全归入无显色反应集和N2。对集合N1中所有子域求均值得到T线局部强度G2，见式（5）： （） (5)测试线显色强度Gt由测试题的全局显色强度和局部显色强度加权得到，见式（6）： (6)k1、k2分别为全局强度和局部强度的权值，且满足。胶体金试纸条测试线显色深浅对应的是待检测溶液中甲霜灵浓度信息。测试线显色深浅用显色度Grad来表示，定义见式（7）。配置甲霜灵标准溶液，测量标准曲线，建立测试线显色度与浓度之间关系式，测量中，根据测试线显色度计算出甲霜灵浓度值。 (7)4实验及其结果实验中采用纯度为97.5%甲霜灵农药标准品，稀释配制2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL等6个不同浓度甲霜灵标准液。胶体金试纸条显色为动态反应，从滴定开始定时4 min，检测此时甲霜灵胶体金试纸条显色度，一般试剂从滴定到与测试线完全反应需要23 min时间，实验中，采集滴定后3分45秒、4分、4分15秒时间点的3幅图像，作为后续图像处理原始数据。图6是试纸条与不同标准液作用后显色图像。图中处于上面的黑线是质控线（控制线）与质控线对齐处于下部的是样本显色线，又称测试线。从图中可以看出，质控线显色深而且边缘规则，与背景区分度大；样本线显色深度随着标准溶液浓度增大逐渐变小，当浓度大于等于20 ng/mL时，测试线与背景已无明显区分度，而且边缘界限模糊。图6(a)(f)分别是2、5、10、20、40、50（ng/mL）标准液试纸条显色图像Fig.6 (a)(f) Strip images of 2, 5, 10, 20, 40 and 50 (ng/mL) standard metalaxyl solutions对不同浓度的样本重复测量15次，分析所得到试纸条测试线显色度数据结果见表1。表1试纸条重复性实验数据 Table 1 Expermental data of stripes (ng/mL)浓度2510204050显色级均值0.410.350.290.230.170.15标准方差0.100.030.050.050.010.02最大偏差0.150.070.110.130.020.05从表1可以看出，显色度值和浓度值之间存在较好的对应关系，对显色度Cy与浓度Cx线性拟合得一次曲线为： (8)R2=0.87，说明二者有明显的线性关系，显色度值可以较好地用于定量分析农药残留。而在浓度大于等于 40 ng/mL时，试纸条显色不明显，人眼很难分辨，仪器读出值小于0.15，可定性判断此时为阳性条。仪器重复性测试表明对不同浓度其显色值有较好一致性，但仍有一定的重复性误差，产生误差的原因：一方面胶体金显色是动态生化反应，而且胶体金颗粒大小和均匀度，反应时间长短，温度以及抗原、抗体活性，以及试样条的生产工艺都会影响胶体金显色结果；另一方面图像检测本身有背景噪声，当显色明显、浓度较低、条纹与背景对比度较大时，对结果影响不大。反之，当图像对比度不大时的影响较大。因此对甲霜灵进行完全定量检测还是存在一定困难的。5结论本文设计了一种基图像测量甲霜灵胶体金试纸条分析仪，仪器采用高亮LED进行照明，通过CMOS图像传感器获取试纸条图像，综合运用计算机技术和数据统计技术理解、分析和判断图像，获取试纸条检测结果，能够实现大量检测结果存储和数据的分析，并且具备小型便携特征。本文通过甲霜灵实验说明，本分析仪能够对甲霜灵农药残留实现定性分析和半定量检测，可广泛应用于现场快速检测。参考文献1 庄无忌. 各国食品和饲料中农药兽药残留限量大全M.北京:对外经济贸易出版社, 1995.ZHUANG W J. 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