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脂肪酶测定方法的探讨目 录中文摘要：太简单了，摘要部分要简要的把你所做实验简单而要的概括出来！ 对碱性脂肪酶酶活的测定方法进行了研究, 通过根霉发酵产脂肪酶和酶的粗分离基本可得到纯度较好的酶的组分，对分离酶过程中的硫酸铵浓度的影响进行研究，得到能不影响酶活的最佳硫酸铵浓度，对脂肪酶的最佳反应pH进行测定，并研究在最佳pH下缓冲液的离子浓度等对酶活测定是否造成影响。关键词： 脂肪酶；制备；粗分离；酶活力。0 前 言前沿部分把握重点，不要什么话都往上乱说！你可将重点放在脂肪酶的应用上。碱性脂肪酶在国际市场上还是一个新酶种。碱性脂肪酶是在碱性条件下水解的脂肪酶，生产的主要原料为小麦、玉米等农副产物，通过生物发酵技术转化。它可以水解天然油脂，产生脂肪酸和甘油，是一种专门在异相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。由于三磷酸钠作为助洗剂在洗涤剂中的大量使用，导致了江河湖泊产生“过肥化”，给生态环境带来危害。于是许多国家在开发具有良好效果的低磷或无磷洗涤剂，酶作为一种助洗剂正是顺着这个潮流而发展起来的1.2。又因为洗涤剂中碱性的居多，尤其是家庭用洗涤用品，所以各种应用于洗涤剂行业的碱性酶制剂大量产生。国外加酶洗涤剂在洗涤剂总产量中的含量近年来也逐年升高，其中日本加酶洗涤剂高达95%左右;西欧达90%。国内目前在各种洗涤剂用酶上的研究也己有很大进展。脂肪酶是一种高活性的生物催化剂，对脂类化合物分解有催化作用，反应是在油水界面上进行的。它可使甘油脂水解成一甘油二脂、单甘脂和脂肪酸，因而利于衣物中皮脂类污垢的除去。同时反应不须要辅助酶，4且本身无毒，并能被生物完全降解，.对环境无污染。我们常用各种含酶洗衣粉，其中的酶制剂主要有碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。碱性蛋白酶用于分解蛋白质类污物，如汗渍、血渍等。碱性脂肪酶则主要作用于脂肪酸及其酯类污物，也就是我们通常所指的油污类。脂肪酶的水解底物一般为天然油脂,其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键,反应产物为甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸。该反应的重要特征是异相系统反应,即在油-水的界面上作用1,再加上酶解反应本身是一个机制十分复杂的催化反应,反应速度较慢,这就决定了反应的不稳定性。许多因素都会影响酶解反应的速度,如反应底物的种类及形态、稳定时间、反应体系的酸度、温度等。脂肪酶可将甘油酯（油、脂）水解，在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH =RCOONa+H2O脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。 0.1 脂肪酶的来源脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是霉菌和细菌。已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌，7种来自细菌。0.2脂肪酶的应用 0.2.1食品工业 利用酶作用后释放出的链较短的脂肪酸，增加和改进食品的风味和香味；利用脂肪酶催化的醇解和酯化反应来生产各种香精酯，作调料剂；用有1,3专一性的微生物脂肪酶提高食用油营养价值和增加食用油的花色品种，制备代可可酯等高档油脂；另外，脂肪酶还可以用于酒类的去浊除渣、改善面包质量，改善蛋白的发泡等等方面。利用脂肪酶来生产兼具机能性与保健疗效的新结构油脂及其衍生物，例如油脂改造 ( 例如可可脂替代品、增加一般动植物油脂中 PUFA 的含量。 ), 乳化剂 ( 例如 glucose esters), 抗氧化剂 , 香料等，不仅增加油脂的广泛应用性，也提升油脂工业的经济效益与发展潜力。 0.2.2洗涤剂工业 Novo公司首先将含脂肪酶的洗涤剂推向国际市场，作为洗涤剂的增效剂，该酶在1560、pH9.0以上的条件下可去除油污。用来做为家庭或工业用清洁剂的添加物，是脂肪酶的最大商业应用领域。根据统计， 1995 年全球的酵素销售总值约在 3 千万美元，其中清洁剂酵素就占了百分之三十，平均每年估计有一千公吨的脂肪酶被加到一百三十公吨的清洁剂中。0.2.3有机相脂肪酶催化合成精细化学产品 八十年代，用脂肪酶在有机溶剂中催化合成低分子量羧酸酯系列香精酯、萜烯醇酯、中长链脂肪酸短链醇酯及长链脂肪酸长链脂肪醇酯等系列产品的研究开发取得了显著进展，且产品可归入GRAS(一般认为是安全的)范畴，视作天然的“绿色”替代品。 目前酶法合成酯产品已从实验室研究迈向工业化生产，成为补充和取代部分化学合成产品的又一新的生产工艺，在生产实际中很多酯化产品如生物柴油、维A棕榈酸酯、棕榈酸异辛酯等产品在经济和环保两方面的优势已经超过了化学合成法。 0.2.4消旋混合物的光学拆分 酶催化反应的高效性、高立体选择性及温和反应条件使得酶催化拆分法可用于某些用一般法难以拆分的手性化合物。脂肪酶是水解酶,对广泛的底物能催化不对称水解或不对称酯化。脂肪酶对手性化合物如醇、羧酸、酯、酰胺和胺等均有较好的立体选择性,因此脂肪酶被广泛地用来拆分外消旋醇和羧酸。拆分的主要途径为立体选择性水解、酯化或转酯反应。 用乙烯基酯为活性酯，在无水二氯甲烷中用假单胞菌脂肪酶催化氰醇的化学拆分，得S型醇，经化学转化合成-肾上腺素抑制剂。此外，脂肪酶还用于酯环仲醇的拆分，拟除虫菊酯中间体的拆分，除草剂对甲氧基苯甲酸基奈普生、布罗芬的拆分等025纺织工业一、精炼 (scouring) 木棉纤维，方法简单且不伤木棉纤维；二、去除蚕丝及羊毛上的油脂 (degumming) 。皮革工业用于兽皮的去油脂处理 (degreasing) ，可增加铬在兽皮上的吸收与分散、增加染料的吸收、减少化学药剂的用量及去油脂处理时间、减少铬在废水中的排放量与废水的污染性。清洁剂工业将嵌在衣物纤维间的脂肪污垢分解去除。油脂化学工业生产高价值的油脂。 026环保业一、废水处理及清理排水管；二、去除造纸用白水及冷却水的黏泥 (slime) 。 027脂肪酶在制药工业的应用 利用脂肪酶独特的立体镜像选择性 (Enantioselectivity) ，可以有效率地区别具有光学活性的立体异构物，以合成多种药物如非类固醇之抗发炎药物 ( 如 naproxen, ibuprofen,suprofen and ketoprofen),nikkomycin-B 等抗生素 , 抗病毒药物 ( 如 lamivudine ，可用来对抗爱滋毒 HIV), 抗癌药物、 alkaloids 、以及维生素等。 028脂肪酶在生物感应器工业的应用 采用化学方法来定量分析脂质成份，不但花费昂贵而且耗费时间，较不符合经济效益。以脂肪酶作成的生物感应器，是一种较为新的方法。脂肪酶生物感应器除了已被应用在临床样本的诊断外，新的应用领域还包括食品工业、饮料工业、环境污染物 ( 如杀虫剂 ) 之分析以及制药工业等。029其它应用一、隐形眼镜片清洁剂的添加物；二、化装品及洗发剂的添加物。 1 材料与方法1.1 材料碱性脂肪酶(江苏省丹凤集团公司生产);聚乙烯醇(分子量1750,北京旭东化工厂产品);三丁酸甘油酯;橄榄油(cp)及其它无机试剂。1.2 仪器恒温水浴锅,精密酸度计,磁力搅拌器,高速组织捣碎机等。1.3 试验方法1.3.1 反应底物乳化液的制备 称取30 g聚乙烯醇(PVA),加900 ml水,加热溶解,冷却后用6 mol/L氢氧化钠调至pH为10.0,过滤,定容至100 ml.量取上述PVA溶液150ml,加入橄榄油50ml,用高速组织捣碎机搅拌6min,4000r/min,前后各3 min,间隔5 min,液备用。1.3.2 0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的制备 称取1.88 g甘氨酸,加入约480 ml水溶解,用6 mol/L氢氧化钠调节pH至10.0，定容至500 ml,备用。需新鲜配置。1.3.3 0.05 mol/L氢氧化钠溶液的制备 取4.5 g固体氢氧化钠溶于1 L水,用邻苯二甲酸氢钾标定,使用时再稀释一倍。1.3.4 酶活的定义 在反应条件下,每分钟催化脂肪水解产生1mol脂肪酸的脂肪酶量，定义为一个脂肪酶国际单位(u).1.3.5 酶活的测定 在三角瓶中,加入一定量缓冲溶液和乳化液,放入一定温度的恒温水浴锅中,再加入酶液反应并计时,一定时间后终止反应,用0.05 mol/L氢氧化钠滴定游离出的脂肪酸,同时做空白样(先加终止剂,后加酶液,其余同样品操作)2。1.36酶活的计算 酶活=(V-V0)t50n其中:V为样品所耗碱的体积(ml)V0为空白耗碱的体积(ml)t为反应时间(min)n为稀释倍数50为1ml 0.05 mol/L氢氧化钠的微摩尔数2结果与分析2.1脂肪酶的制备211固态发酵生产脂肪酶的特点这部分实验你做了吗？没做怎么随便分析！固体基质发酵( solid substrates fermentation, SSF)广义的定义是指一切使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程。固态发酵生产脂肪酶的微生物很多,大多数是真菌, 如Penicillium simplicissimum, Penicilliumverrucosum, Penicillium restrictum, Penicillium candidum,Rhizopus homothallicus, Rhizopus rhizopodiform is, Rhizopusoligosporus, Rhizopus chinensis, Rhizomucor pusillus,Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Candida rugosa, Yeastlipolytica 等, 部分细菌如B urkholderia cepacia ,Pseudomonas aeruginosa, B acillus coagulans等也可以采用固态发酵方式生产脂肪酶。与液态深层发酵( submergedfermentations, SmF)相比,它具有以下优点 7 : (1)培养基简单且来源广泛,多为便宜的天然基质或工农业生产的下脚料; (2)投资少、能耗低、技术较简单; (3)产物的产率较高; (4)基质含水量低,可大大减少生物反应器的体积,不需要废水处理,环境污染较少,后处理加工方便;(5)发酵过程一般不需要严格的无菌操作; (6)通气一般可由气体扩散或间歇通风完成,不需要连续通风,空气一般也不需严格的无菌空气。固态发酵的缺点是发酵不均匀,菌体生长、营养物的吸收和代谢产物的分泌在各处都是不均匀的,存在严重的浓度梯度及传热、传质困难,使得发酵参数(pH、热、营养条件等)的检测和控制均比较困难,较难实现工业化。固态发酵中的微生物在接近自然的环境中生长,具有更高的代谢活性。真菌酶的固态发酵生产与液态发酵相比,生产力较高,底物抑制效应较弱,产酶具有较高的温度和pH稳定性,发酵时间可缩短,且酶被蛋白酶降解的机会降低 9 。固态发酵产生脂肪酶的热稳定性高,可能产性质不同的同功酶,有些菌种采用固态发酵还具有明显的优势。Mateos等 10 固态发酵生产的Rh. hom othallicus脂肪酶比液态发酵的具有更高热稳定性.2.1.2脂肪酶固态发酵的影响因素2. 1.2.1基质固体发酵过程最大的优势是培养基的原料非常便宜。选择合适的基质对固态发酵至关重要。表1是当前用于各种脂肪酶生产的基质和微生物。用于脂肪酶生产的固态基质可分为两大类:惰性材料,它只作为微生物的固定载体;非惰性材料,不仅作为载体,还作为一些微生物生长需要的营养物质 3 。后者也被称为底物基质,在脂肪酶的固态发酵中应用最为广泛。惰性材料虽然具有胞外产物与惰性基质分离方便、产物回收比非惰性基质体容易、而且产物纯度高等优点,但培养基成本高,单位基质的产酶量较低,因此在脂肪酶的固态发酵中很少采用。非惰性材料主要为工农业产品的副产品及其废弃物。它们不仅来源广泛,价格低廉,而且利用这些材料还能解决它们的废弃造成的环境污染和高值化利用问题。甘油三酸酯和脂肪酸的存在能诱导脂肪酶的分泌,食品和工农业废物富含脂肪酸、甘油三酯和糖,能用来作为固态发酵的底物提高脂肪酶的产量。Dominguez 等 18 报道以工农业食品废弃物(落地的果子和麦麸、麦糠)作为底物载体在固态发酵生产Y. lipolytica脂肪酶时具有巨大的潜力, 与惰性载体相比脂肪酶的活性提高了5倍。微生物要在底物上进行生长并产生代谢产物,必将受到底物本身的物理性能(底物颗粒大小、空隙率、黏度、形状、纤维含量、颗粒之间扩散率等)和化学性能(疏水性、聚合度、结晶度及电化学性质等)的影响 31 。底物颗粒的尺寸在固态发酵中对微生物的生长与活性非常重要。底物粒径小可以提供较大的表面积供微生物生长,可以明显提高固态发酵反应速率。但是底物粒径太小容易造成底物团聚,对传热、通气产生不利影响;同时,大颗粒由于存在较大间隙有利于提高传质和传热效率,还可提供更好的呼吸及通气条件,但表面积小,不利于菌体的生长和酶的分泌 3 。Rao等 19 利用米糠进行固态生产脂肪酶时, 发现基质的颗粒由500m降低到177m时,脂肪酶活性提高了2倍。采用复合底物作为基质通常能有效提高脂肪酶的产量。Mala等 27 以麦麸和芝麻油饼质量比为31组成的混合底物为基质固态发酵生产A. niger脂肪酶,发现脂肪酶活力比以麦麸为单一底物提高了36. 0%。Benjamin等 28 以混合底物为基质(椰子油饼精麦麸粗麦麸= 111)固态发酵生产C. rugosa脂肪酶,比以椰子油饼为基质生产脂肪酶的产酶周期缩短24h,产量提高38%。近期我们以两种油脂加工的副产物为复合基质对B. cepacia 固态发酵产脂肪酶进行了探索性研究,初步的研究结果表明: 复合底物比单一底物产酶高,所产脂肪酶的热稳定性也比液态发酵的高,冻干的脂肪酶粗酶粉可以直接应用到酯化和转酯化反应中。2. 1.2.2培养基含水量及空气湿度水是固态发酵的主要媒质,基质含水量的高低直接影响微生物的生长和脂肪酶的生物合成。脂肪酶固态发酵基质含水量与水活度有关, 维持发酵过程要求一定的水分含量,水活度影响到菌体的生长状态, 也是大部分固态发酵反应器设计的重要考虑因素。含水量可由基质的性质、产物的类型以及微生物的需要来决定。高的含水量可导致多孔性降低、氧扩散受限制,并增加细菌污染的机会。低含水量则使基质膨胀程度降低、水张力增高,从而使生长受抑制。因此,应考虑选择适当的起始含水量,并在发酵过程中采用适当方式补充水的蒸发损失。一般起始含水量控制在30% 75%范围内。吴克等 32 报道固态培养基含水量对Rhizopus sp. 产脂肪酶有较大影响,含水量为55. 6 %时脂肪酶的产量最高。总之,固态发酵的湿度一般在30% 80%之间,细菌的湿度一般高于70% ,丝状真菌在0% 70%之间。Kempka等 29 采用响应面法优化了P. verrucosum 固态发酵生产脂肪酶的条件,结果发现温度和起始湿度是影响产酶的显著因素,最佳培养温度为27. 5C,最佳底物起始湿度为55%。2.1.2.3温度大多数真菌的固态发酵温度一般在27C29C之间。温度对菌体的生长和代谢以及脂肪酶的分泌都具有重要的影响,是脂肪酶固态发酵中重要的物理参数。散热问题是固态发酵的一个重要问题,固态发酵反应器的设计主要考虑的是将散热对固态发酵的影响降到最小。Di Luccio等 33 以大豆饼作为固态发酵生产P. sim plicissim um 脂肪酶的固态底物,考察了温度、湿度和碳源对产脂肪酶的影响。温度是影响最大的因素,为负效应,其它均为正效应。2.1.2.4通气在固体发酵中,由于单位体积内的基质浓度和菌体浓度远远高于液体深层发酵的相应值,其热量产生也远高于液体发酵。另外,固态发酵物的含水量低,热容量也低,传热也困难。因此固体发酵的温度控制比液体发酵要困难得多,尤其在厚层大规模培养时更为严重。固体发酵中的散热方法有多种,包括向发酵器中大量通风,用浸水的粗麻布覆盖培养盒,将发酵器置于控温室或恒温水浴中,向发酵器夹层间通循环水等。其中,通风是最常用的方法。当发酵温度高时,可增加通风量以除去多余热量;当发酵温度低时,则可降低通风量,甚至暂时停止通风。一般低温和高的通气量有利于脂肪酶的生产 34 。Gutarra等 35 报道当通入空气的表观线速度大于55 cm /min,温度低于28C时脂肪酶活力最高。2. 1.2.5培养基向固态基质中添加不同的培养基对脂肪酶的生产也具有重要影响。Venkata 等 36 发现0. 25% 尿素、4. 5%麦芽糖和15% 橄榄油有利于C. rugosa 菌体生长, 而0. 5% 尿素、1. 5% 麦芽糖和7. 5%橄榄油有利于脂肪酶的产生。碳源一般对固态发酵生产脂肪酶的影响较小。de Azeredo 等 16 报道固态发酵生产.restrictum 脂肪酶时不同的碳源对脂肪酶的生产影响不大,葡萄糖是固态发酵生产脂肪酶的最佳碳源,可能是这种发酵方式减小了碳源的反馈抑制作用。不同添加剂的存在(糖类、表面活性剂、蛋白质等)也会对脂肪酶的生产产生重要影响。Kamini等 20 报道各种碳源、氮源对A. niger固态发酵产酶影响不大,淀粉对脂肪酶的生产有一定抑制作用。在许多固体发酵工艺中,氮源的种类和含量往往是影响产酶的显著因素。许多学者报道尿素为固态发酵产脂肪酶的最佳氮源 19, 23, 24 。也有报道无机氮源如NaNO3 ,NH4NO3 等有利于脂肪酶的固态发酵 3, 7, 38 。无机盐的加入也可能对脂肪酶的分泌以及稳定存在产生影响。Alkan 等 38 报道Ca2 +能使脂肪酶的产量提高5%。吴克等 32 证实在培养基中分别添加8. 0g/L的Ca2 +和4. 0g/L的Mg2 +离子时脂肪酶活力最高。2. 1.2.6其它影响因子pH也是影响真菌生长代谢的关键因素之一,用于固体发酵的某些基质对其变化具有良好缓冲性,因而减少了对pH控制的需求。不同的接种方式(液态孢子和固态孢子)对固态发酵有较大影响。以棕榈油饼为基质固态发酵生产P. mplicissimum 脂肪酶,分别采用液态接种和固态接种两种方式,固态接种比传统的液态接种方式生产力提高了1. 5倍,接种量也减少了10倍 36 。2.1.2获得最佳酶活的培养时间2.1.3盐析获得三个酶分的硫酸铵浓度2.1.4获得最佳酶活的缓冲液pH2.2脂肪酶的粗分离2.2.1浸提2.2.2离心2.2.2盐析向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后,可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，可复原。向某些蛋白质溶液中加入某些重金属盐，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作变性，性质改变，无法复原。蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。2.2.3透析透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，就叫做透析袋。 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。 透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。 透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4透析，升高温度可加快透析速度。 商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50乙醇煮沸1小时，再依次用50乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。 新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。透析袋预处理方法 - (1)将透析管剪成适当长度，10-20cm的小段，即形成透析袋 （2）在大体积2（m/V）碳酸氢钠和1mmol/LEDTA（PH*8.0）中将透析袋煮沸10min （3）将透析袋用蒸馏水彻底漂洗 （4）将透析袋置1mmol/L EDTA（PH*8.0）中煮沸10min （5）将透析袋冷却，存放于4摄氏度，应确保透析袋始终浸没在液体中。 重要：从此步起用透析袋时一定要带手套操作 （6）在使用前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。 用过的透析袋保存前需要怎么处理？用生理盐水浸泡以去掉蛋白，并用蒸馏水清洗干净，然后置50乙醇中保存即可；用完以后,要彻底洗干净,透析袋也可以保存在0.1%叠氮钠（可防止微生物生长）里；0.05%-0.1%叠氮钠，或者1mM EDTA，或者50甘油中4度保存，公司的人建议前两种保存比较好！2.2.4冻干干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一。干燥的方法许多，如晒干、煮干、烘干、喷雾干燥和真空干燥等。但这些干燥方法都是在0以上或更高的温度下进行。干燥所得的产品，一般是体积缩小、质地变硬，有些物质发生了氧化，一些易挥发的成分大部分会损失掉，有些热敏性的物质，如蛋白质、维生素会发生变性。微生物会失去生物活力，干燥后的物质不易在水中溶解等。因此干燥后的产品与干燥前相比在性状上有很大的差别。 而冷冻干燥法不同于以上的干燥方法，产品的干燥基本上在0以下的温度进行，即在产品冻结的状态下进行，直到后期，为了进一步降低产品的残余水份含量，才让产品升至0以上的温度，但一般不超过40。 冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。 冷冻干燥有下列优点： 一冷冻干燥在低温下进行，因此对于许多热敏性的物质特别适用。如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力。因此在医药上得到广泛地应用。 二在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小，适合一些化学产品，药品和食品干燥。 三在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性装。 四由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象。 五干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。 六由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护。 七干燥能排除95-99%以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质。 因此，冷冻干燥目前在医药工业，食品工业，科研和其他部门得到广泛的应用。冻干机的组成和冻干程序 产品的冷冻干燥需要在一定装置中进行，这个装置叫做真空冷冻干燥机，简称冻干机。 冻干机按系统分，由致冷系统、真空系统、加热系统、和控制系统四个主要部分组成。按结构分，由冻干箱或称干燥箱、冷凝器或称水汽凝集器、冷冻机、真空泵和阀门、电气控制元件等组成。图十三是冻干机组成示意图。 冻干箱是一个能够致冷到-40左右，能够加热到+50左右的高低温箱，也是一个能抽成真空