生化笔记第二部分 核酸化学.doc

4免费考研论坛核酸化学一、核酸的种类和组成单位1、根据核酸的化学组成和生物学功能，将核酸分为： 核糖核酸（RNA）和 脱氧核糖核酸(DNA)所有细胞都同时含有DNA和RNA两种核酸。病毒只含一种核酸，DNA或RNA，故有DNA病毒和RNA病毒之分。多数细菌病毒（噬菌体）属DNA病毒，而植物和动物病毒多为RNA病毒。DNA：主要存在于细胞核（真核细胞，98%以上），是染色质的主要成分；原核生物DNA主要存在于类核中；在核外也存在有少量DNA，如线粒体DNA、叶绿体DNA以及细菌的质粒（细菌染色体外能够进行自我复制的遗传单位）。RNA主要存在于细胞质中: mRNA：约占细胞总RNA的5%，在蛋白质合成中起模板作用； rRNA：占细胞总RNA的80%，是核糖体的组分，是合成蛋白质的场所； tRNA：占细胞总RNA的10-15%，蛋白质合成中起携带活化氨基酸的作用；2、组成：核酸是由核苷酸组成的，核苷酸是核苷的磷酸酯，核苷由碱基和核糖/脱氧核糖组成，碱基有嘌呤和嘧啶两类。DNA组成： 脱氧核糖、 磷酸、A、G、C、TRNA组成： 核糖、磷酸、A、G、C、U（1）碱基： NH2 OCH3 O ONH2OO O NH2胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤嘌呤和嘧啶环中均含有共轭双键，因此对波长260nm左右的紫外光有较强吸收，这一重要的理化性质被用于对核酸、核苷酸、核苷及碱基进行定性定量分析。（4）戊糖：DNA分子的核苷酸的糖是-D-2-脱氧核糖，RNA中为-D-核糖。（3）磷酸：生物体内多数核苷酸的磷酸基团位于核糖的第五位碳原子上。二、核酸的分子结构（一）DNA的分子结构1、一级结构DNA的一级结构指的是组成DNA分子的脱氧核苷酸的连接方式和排列顺序。 DNA是由很多个dAMP、dGMP、dCMP和dTMP通过3,5 -磷酸二酯键连成的无分支双链线状或环状多核苷酸。生物体的性状由DNA决定，生物性状多种多样，因此在DNA一级结构上，一定是不同的段落有不同的功能，不同的生物性状由相应的DNA片段来决定；核酸为多聚核苷酸,相邻2个核苷酸间以3,5-磷酸二酯键连接 。DNA分子中链骨架是固定不变的，脱氧核糖核苷酸的排列顺序实质上是碱基的排列顺序。 核酸链的简写式：核酸分子的简写式可简明表示高度复杂的核酸分子。简写式表示的是核酸分子的一级结构，即核酸分子中的核苷酸（或碱基）排列顺序。书写方式由5 3 端。2、二级结构：DNA双螺旋结构是核酸的二级结构。双螺旋的骨架由糖和磷酸基构成，两股链之间的碱基互补配对，是遗传信息传递者，DNA半保留复制的基础，结构要点：a.DNA是一反向平行的互补双链结构亲水的脱氧核糖基和磷酸基骨架位于双链的外侧，而碱基位于内侧，碱基之间以氢键相结合，其中，腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对，形成两个氢键，鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对，形成三个氢键。b.DNA是右手螺旋结构螺旋直径为2nm。每旋转一周包含了10个碱基，每个碱基的旋转角度为36度。螺距为3.4nm，每个碱基平面之间的距离为0.34nm。c.DNA双螺旋结构稳定的维系横向靠互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持，尤以后者为重要。3、三级结构：三级结构是在双螺旋基础上进一步扭曲形成超螺旋，使体积压缩。在真核生物细胞核内，DNA三级结构与一组组蛋白共同组成核小体。在核小体的基础上，DNA链经反复折叠形成染色体。（二）RNA的分子结构1、tRNA的结构：tRNA由7393个核苷酸组成，分子量为2500030000dalton，沉降系数4S ，含较多的稀有碱基（修饰碱基），占总RNA 的16%，种类多。（1）一级结构：分子量最小，含7590 个核苷酸，3末端都具有CPCPAOH的结构，即最后一个是腺苷（核糖3位非磷酸化）；（2）二级结构：不同的tRNA具有相似的高级结构，tRNA分子单股链通过自身折叠形成四个螺旋区和四个环的基本结构，类似一个三叶草，称为三叶草结构。tRNA分子中含有氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TYC环五部分。氨基酸臂 ：7bp组成，富含G，5-pG或pC，3-CCA-OH，氨基酸连接在腺苷酸残基(A)上。TC环：由7个碱基组成，参与tRNA与核糖体表面的结合。额外环或可变环：碱基种类和数量（318个碱基）高度可变，并富含稀有碱基。环的大小与生物种类有关，作为tRNA分类的指标。反密码子环：由7个碱基组成，处于中间位的3个碱基为反密码子，常含有次黄嘌呤核苷酸。反密码子可与mRNA中的密码子结合。二氢尿嘧啶环：由812个碱基组成，具2个二氢尿嘧啶(DHU)。（3）三级结构：tRNA的三级结构：tRNA的三维结构是倒“L”形。（4）tRNA的作用：是携带活化氨基酸参与蛋白质合成。2、mRNA的结构真核细胞的mRNA 3末端有一段可长达200个左右的多聚腺苷酸，称为“尾”结构。表示为polyA 5；末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽”结构。表示为：m7GPPPXmPY.这种“尾”和“帽”结构在mRNA的功能中有重要作用。典型的真核mRNA的结构顺序是： 帽子结构区-5非编码区-起始密码-编码-终止密码-3非编码区-polyA尾巴。 真核生物mRNA一级结构特点：真核生物帽子结构的复杂程度与生物进化程度关系密切。mRNA 5-端帽子结构是mRNA翻译起始的必要结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号；这种帽子结构还可能增加mRNA的稳定性，保护mRNA 免遭5 3核酸外切酶的攻击，同时也与mRNA的翻译活性有关。绝大多数真核mRNA的3-末端有一段长约200个残基的Poly（A） 。原核生物mRNA一般无此结构。Poly（A）尾巴是转录后在核内加上的。Poly（A）尾巴的功能可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关。但是相当数量的没有polyA尾巴的mRNA如组蛋白mRNA，也能通过核膜进入细胞质。 这种结构可能对真核mRNA的翻译效率具有某种作用，使mRNA较容易被核糖体辨认，并能稳定mRNA结构，保持一定的生物半衰期。原核生物mRNA一般为多顺反子(polycistron)，即在同一mRNA中含有编码多个蛋白质的信息(一个基因即一个顺反子)；真核mRNA通常是单顺反子，一个mRNA只能编码一条多肽链。3、rRNA的结构种类较多，分子中修饰成分较少；rRNA分子量为103106D， 存在于核糖体中，核糖体中有60%是rRNA，其余40%是蛋白质。 原核生物大肠杆菌的rRNA有5S、16S和23SrRNA三种，动物细胞有5S、5.8S、18S和28S rRNA四种三、核酸的理化性质（一）、核酸的一般性质1、溶解性RNA为白色粉末状，DNA是白色纤维状固体，二者均溶于水，而不溶于一般有机溶剂中，故常用冷乙醇从水溶液中将核酸沉淀出来。2、两性性质核酸是两性电解质，但酸性强，与金属离子结合成盐，也可与碱性蛋白（组蛋白）结合；介质pH大于4时，呈阴离子，电泳时向阳极移动；DNA在pH411间最稳定，超出此范围易变性。（二）核酸的紫外吸收特征核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基中含有共轭双键体系，因而具有特殊的紫外吸收光谱，其最大吸收峰位于260nm处。利用这一性质可定量测定核酸的含量或鉴定核酸的纯度。（三）核酸的变性及复性1、核酸的变性概念：核酸的变性是指因某些理化因素的影响使维持核酸空间结构的氢键和疏水键断裂，双螺旋结构解体，但不涉及核 苷酸间共价键的断裂。 核酸变性后，粘度降低，紫外吸收值增高(增色效应)，生物功能消失。 影响变性的因素：破坏双螺旋稳定性的因素都可使DNA变性。 DNA分子中的碱基处于配对和不配对的动态平衡状态，很多因素会引起它向不配对方向转变，即引起DNA变性。如高温、强酸、强碱、有机溶剂(乙醇、丙酮等)、尿素、酰胺等试剂、射线等。高温：DNA稀盐溶液加热到80100，几分钟内双螺旋键即解开，形成无规则的线团。离子强度：提高溶液的离子强度，可中和DNA分子链上磷酸基团的负电荷，降低它们之间的排斥力，稳定DNA的结构。DNA通常保存在1molNaCl中。极端的pH值：pH1时，DNA的磷酸二酯键会被水解；pH11.3时，DNA的所有氢键断裂。疏水作用：甲醇可增加碱基的溶解度，三氟醋酸钠可降低DNA分子的疏水作用，破坏双螺旋结构引起变性。 DNA的熔点（Tm）：DNA的热变性过程中光吸收达到最大吸收一半时的温度称为 DNA的解链温度(简写Tm)或熔点，用 Tm 表示。DNA的Tm值一般在7085之间。热变性是在很狭的温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的熔化现象，故名熔解温度。（4） Tm的影响因素：DNA的均一性高：Tm的范围越小。DNA的(G+C)含量：Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高，Tm值越高。故测定Tm，可反映DNA分子中的G,C含量。公式如下：(G + C)% = (Tm 69.3)2.442、核酸的复性概念 变性DNA在适当的条件下(除去变性因素)，可使两条分开的链按照碱基配对规律重新缔合成双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA其理化性质和生物功能都得到部分恢复。复性的DNA溶液紫外吸收下降称为减色效应。影响复性的因素温度和时间一般认为比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。 复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4以下)，复性几乎是及不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。 降温时间太短以及温差大均不利于复性。DNA浓度：浓度越大，复性越快。DNA顺序的复杂性：简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(T)这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。顺序复杂的DNA，如小牛DNA的非重复部分，一般以单拷贝存在于基因组中，这种复杂特定序列要实现互补，显然要比简单序列困难得多。四、核酸的分离与纯化（一）分离核酸的一般原则提取时应注意以下几点：1、防止核酸酶的降解： 细胞内凡有核酸的部位，都有降解该核酸的酶存在。故应加入酶的抑制剂降低其活性，如柠檬酸钠，EDTA等；2、防止化学因素的降解：提取时常用到强酸强碱，要注意强酸强碱的降解作用；3、防止物理因素的降解： 应在低温和避免剧烈搅拌下进行；（二）DNA的分离纯化1、 DNP蛋白的提取细胞提取物 加1 mol/L NaCl DNP溶解 DNP溶解 分离（DNP和RNP) RNP沉淀稀释NaCl至0.14 mol/L 离心DNP溶液 DNP沉淀 DNP蛋白2、除去DNP中的蛋白质（1）SDS法SDS（十二烷基硫酸钠）可使蛋白质变性，从而使DNA与蛋白质分开；（2）苯酚法 苯酚 变性蛋白质在苯酚相， 酒精 DNP蛋白 DNA在水相 离心 DNA沉淀3、 DNA的纯化 （1）蔗糖密度梯度离心：分离分子量大小不等的DNA （2）氯化铯密度梯度离心分离双链和单链DNA；（3）柱层析：分离天然DNA和变性DNA三.RNA的分离纯化（三） RNA的分离纯化1、RNA的提取酚提取