转基因技术在小麦上的应用.doc

转基因技术在小麦上的应用植物转基因技术是指利用重组技术、细胞DNA培养技术或种质系统转化技术将目的基因导人植物基因组，并能在后代中稳定遗传，同时赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。常规育种常常受有性杂交亲和性的制约，而利用转基因技术可以打破物种界限、克服有性杂交障碍，快速有效地创造遗传变异，培育新品种、创造新类型，大大缩短新品种育成的时间。因此，随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术也蓬勃发展。自1990年Frorrn报道了第一例可育的转基因玉米以来.短短十几年中,利用转基因的途径将外源基因导入玉米，培育出了一批抗虫、抗病、抗除草剂、耐盐、抗旱、优质的玉米品种或优良种质。全世界已有17种转基因玉米被正式批准投入商品化，主要有抗虫玉米和抗除草剂玉米等。截止2007年，全世界转基因玉米种植面积已经达到3520万hm2，占世界玉米总面积的24%；占全球转基因作物总面积的31%。玉米转基因工程主要环节包括建立遗传转化受体系统、明确拟转化的目的基因、建立高效遗传转化体系等 1.遗传转化的受体系统转基因技术的首要条件，是需要建立稳定、便捷和高效的遗传转化受体系统。早期基因导入技术发展不完善，玉米基因转化只能利用来源于胚性悬浮细胞的原生质体细胞作受体，缺点是分化再生植株费时，而且很大程度上依赖于基因型，玉米转基因工程研究受到限制。随着基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法等转基因技术的发展与应用，遗传转化受体系统也多种多样。有胚性悬浮培养细胞、幼胚、幼胚及成熟种子诱导愈伤组织和花粉培养获得的胚性培养物，还可直接利用花粉和卵细胞受精过程实现转基因（主要是花粉管导入法和子房注射法)。除此之外，分生组织、萌发的胚、叶基、芽分生组织也用来作为基因瞬时表达和稳定转化的外植体。 1.1遗传转化的目的基因玉米转基因技术涉及的目的基因主要有报道基因、重要农艺性状的功能基因及近缘或远缘物种的部分或全部基因组。 1.2报道基因 DNA的转移和它在植物细胞中的表达是相互关联的，在转化实验中利用报道基因来研究DNA导入效率及转化基因在细胞中的表达。早期研究中多使用的报道基因是氯霉素乙酰转移酶Cat基因，其检测繁琐费时，且需用放射性试剂。现在最常用的是由大肠杆菌Uid A位点编码的-葡糖苷酸酶gus基因，该基因可以通过组织化学染色或荧光技术快速检测，但检测后组织已被破坏死亡。一些非破坏性、检测灵敏的报道基因正被开发。用调节玉米花青素合成的R基因作报道基因，不需外加底物，合成的花青素清晰可见，很适于玉米的基因转化研究。从水母中得到的新的报道基因绿色荧光蛋白基因(SGFP-S65T)，在检测该基因表达时不致使细胞死亡，不需要外加底物，而且还可用来检测体内的基因表达。荧光素酶基因(luc，lucferase gene)也被用于玉米基因转化的报道基因，检测灵敏度高，但需用的检测设备较为昂贵，对研究低水平表达的弱启动子受调控的方式时十分有利。 1.3功能基因 功能基因是导入玉米并在转基因植株中得到表达的基因。目前主要有抗虫基因、抗除草剂基因、抗病基因、改良玉米蛋白质基因、雄性不育基因、耐盐基因等。 1.4抗虫基因 目前主要利用的抗虫基因是苏云金杆菌的-内毒素基因(Bt)和植物来源的抗虫基因(如蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因)等。王国英等把Cry1A(b)基因导入玉米，育成了稳定的抗虫玉米。 1.5抗除草剂基因 抗除草剂基因中以Bar基因应用最广而且最为成功。来源于吸水链霉素的bar基因被广泛用作玉米基因转化中的选择标记基因。除草剂抗性基因的利用不仅可作选择标记，同时还具有使玉米不受除草剂伤害而显著提高产量的功能。孟山都公司1996年最先注册了抗甘草膦(农达)玉米品种；BASF公司推出拿扑净的转基因玉米杂交种。 1.6高蛋白质基因 即外源种子或人工合成的高蛋白基因，利用转基因技术将其导入玉米，改良玉米的营养品质。如张秀君等将富含赖氨酸的马铃薯花粉特异水溶性蛋白的cDNA转入玉米，种子中赖氨酸含量可提高到10%以上。Sun等育成的转基因玉米种子中赖氨酸含量提高了16%。中国农业大学育成的转基因玉米自交系，其蛋白质含量达到13.2%17.2%。 1.7雄性不育基因 Mariani等将来自烟草花药绒毡层特异启动子TA29与核酸酶基因Barnase融合后转化玉米已成功获得雄性不育植株。刘大文等利用玉米花粉特异启动子Zml3启动核酸酶基因Bar-nase在玉米花粉中表达产生了部分不育的植株。 1.8耐盐转基因 耐盐转基因有近20种，目前应用的主要有以下几种：l磷酸甘露醇脱氢酶基因(mtlD)、6-磷酸山梨醇脱氢酶基因(gutD)、6-磷酸海藻糖合成酶基因(otsA)、6-磷酸海藻糖磷酸化酶基因(otsB)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、脯氨酸合成酶基因(proA)等。刘岩等将大肠杆菌gutD转入玉米，转化体能在2%的盐浓度中生长。 1.9其他性状基因 抗寒性、抗真菌病害基因和抗病毒病基因等。利用转基因玉米生产抗生物素蛋白和-葡糖苷酸酶gus，以玉米为载体生产动物和人类用的疫苗。Breusegem等将FeSOD和MnSOD基因导入玉米、获得抗寒性强的转基因玉米。 1.10部分或整个基因组 即利用部分或整个基因组进行遗传转化。利用基因组DNA导入的方法可迅速有效地获得一些重要性状。丁明忠等利用花粉管通道法和减压渗透法将大豆总DNA导入玉米，筛选到8个高蛋白材料，玉米种子中蛋白质含量比对照提高20%以上。2转基因技术在玉米育种上的应用玉米转基因技术应用领域十分广泛，涉及很多目标现状。主要应用在抗虫转基因玉米、抗除草剂玉米和特种玉米等方面其中抗虫、抗除草剂转基因玉米已经进入商业化应用阶段。抗虫转基因玉米 虫害是制约玉米产量的重要因素，目前，在玉米上解决虫害的主要方法是在玉米植株生长过程中使用化学杀虫剂。但是化学杀虫剂不但杀死害虫，也杀死害虫的天敌长此以往会造成生态平衡的破坏和环境污染的日益严重。种植转基因玉米是替代使用杀虫剂的有效方法。Schnepf等首次成功地克隆了一个编码为Bt的杀虫晶体蛋白基因，该基因转入植物后植物体内能合成毒素蛋白，害虫吃过转入这种基因产生的毒素蛋白后就会死亡，从此揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。美国孟山都公司等改造合成了多种BT杀虫蛋白基因，并转入玉米，并于2003年引入玉米抗根叶甲虫防治基因cry3Bbl和能广泛防治鳞翅目害虫的玉米抗虫基因crylFa2。目前，中国转基因抗虫玉米尚处于田间释放阶段。3抗除草剂玉米抗除草剂基因工程是指将抗除草剂耐性基因引人玉米，这是一种高效、无公害的控制杂草的手段。1986年。Fromm等将抗除草剂pat基因转入了玉米原生质体中，目前已经培育出了抗草甘磷、草铵磷、咪唑啉酮、稀禾定等抗除草剂转基因玉米，经过除草剂抗性稳定性以及大田生产的试验，效果良好，并且已经进入商业化生产阶段。到2005年，抗除草剂转基因玉米的种植面积已达到650万hm2左右，占转基因玉米种植面积的40。 二玉米转基因技术及特点 1载体转化技术 农杆菌是一种天然的植物基因转化系统，其含有的Ti或Ri质粒具有携带外源基因的功能。经过遗传工程的方法对农杆菌及质粒加以改造，并装入外源基因，借助农杆菌对植物的感染特性，将外源基因带入植物细胞内。从而完成转化过程。应用最多的是农杆菌Ti质粒介导的转化系统，该转化系统是目前研究最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。其特点是操作简单，导入外源基因结构完整，可转移50kb大的DNA片断，整合稳定，拷贝数少等。研究发现，不同基因型及不同发育时期的玉米幼胚对农杆菌侵染的感受性有差别，自交系A188的感受性最高。Ishida等建立了农杆菌转化玉米的超级双元载体转化系统、使转化效率高达5%30%、成为玉米遗传转化研究的一个重要里程碑。目前已分离出大量的农杆菌菌株，能有效转化玉米的常用菌株为LBA4404，常用的载体有PSBl31和PTOK233，均为超双元载体，对转化玉米是非常有效的。1999年。黄璐等在国内首次报道了农杆菌转化玉米杂交种成功。随后又有将农杆菌转化玉米常规自交系获得成功的报道。 2DNA直接导入转化技术 亦称无载体DNA介导转化技术，不需依赖生物媒体，而将特殊处理的裸露的DNA直接导入玉米细胞，实现基因的转化。 3基因枪法 基本原理是将外源DNA包裹在微小金粒或钨粒表面，高压作用下微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到染色体上，实现基因转化。基因枪是玉米基因转化常用的方法，也是效果最好的方法，基因枪目前主要有3种：火药枪基因枪、气动式基因枪和放电式基因枪。基因枪转化的优点是：无宿主限制，靶体类型广泛，操作简便、但转化频率低，插入位点、插入拷贝数不定。 4 PEG法 PEG是细胞融合剂，能促进细胞膜间融合，利于外源DNA进入原生质体。PEG法建立较早，它随原生质体的发展而发展。这种方法成本低，结果比较稳定，但效率低。存在的问题是建立可靠高效的原生质体再生系统比较困难。它和电激法结合使用会提高转化效率。 5电激法 利用高压电脉冲作用对细胞“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的摄取。电激法可以用于原生质体，还可以用于胚性悬浮细胞系、愈伤组织和幼胚等。操作比较简单，但转化效率低。 6 超声波介导法 利用超声波处理玉米愈伤组织、细胞或原生质体悬浮液，使细胞表面产生微小的容易愈合的裂缝，使外源DNA进入细胞。超声波介导法转化效率较高，但操作繁琐，载体DNA在处理时易断裂。 7 碳化硅纤维介导法 将一种体积很小的碳化硅晶体纤维与植物细胞一起振荡培养，使附着在碳化硅上的外源DNA分子随纤维晶体穿入细胞。 8 种质系统转化技术 种质系统转化也称生物媒体转化系统，即利用花粉粒、花粉管通道或利用子房、幼穗及种胚注射外源DNA等方法，实现外源基因的导入。研究进展较大的是花粉管通道法和子房注射法。 9 花粉管通道法 基本原理是授粉后外源DNA沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的细胞、合子或早期胚胎细胞。王罡等在玉米授粉后剪短花丝和苞叶，将Bt毒蛋白基因滴在花丝上，得到了转基因后代。花粉管通道法也可与其他方法结合使用，董云州等用基因枪将Gus基因射入玉米花粉，然后人工授粉，后代检测到了Gus基因的表达。王景雪等把玉米花粉和质粒DNA混合后超声波处理，然后人工辅助授粉，将几丁质酶基因导入了玉米。其优点在于玉米花粉量大、易于采集，雌穗结实粒多，操作方法简便。 10子房注射法 使用显微注射仪或微注射针将含有目的基因载体的外源DNA溶液直接注入处于减数分裂时期的子房中，靠子房产生的压力及卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，实现基因的转化。丁群星等首次报道用子房注射法将Bt抗虫毒蛋白基因导入玉米自交系,获得了正常的转化体。沈世华等利用离