成熟T细胞肿瘤与反应性T细胞抗原表达对比研究.doc

成熟T细胞肿瘤与反应性T细胞抗原表达对比研究陈红梅，齐曼，夏成青，孙晓柏，陈杭，信亚文 作者姓名：陈红梅，本科，主治医师，杭州艾迪康医学检验中心病理实验室 310023 Email： 陈杭，本科，检验师，杭州艾迪康医学检验中心病理实验室 310023 信亚文，硕士，杭州艾迪康医学检验中心病理实验室 310023 齐曼，本科，技师，首都医科大学附属北京朝阳医院 100020 孙晓柏，硕士，医师，济南艾迪康医学检验中心 250013通讯作者：夏成青 杭州艾迪康医学检验中心病理实验室 310023 Email：成熟T细胞肿瘤与反应性T细胞抗原表达对比研究陈红梅，齐曼，夏成青，孙晓柏，陈杭，信亚文 摘要目的比较成熟T细胞肿瘤与反应性T细胞白细胞共同抗原CD45、全T细胞抗原CD2、CD3、CD5、CD7及CD4、CD8等的表达差异，探讨上述抗原表达变化在成熟T细胞肿瘤诊断中的价值。方法对36例成熟T细胞肿瘤及36例非T细胞肿瘤患者流式细胞免疫分型资料进行回顾性分析。根据抗原表达及其与正常T 细胞的比较，将T细胞抗原表达模式分为抗原丢失及抗原强度变化。强度变化包括表达减弱、表达增强、双峰表达、表达不均匀等。结果63.9%的成熟T细胞肿瘤有1项或多项全T细胞抗原丢失（23/36），明显高于对照组的8.3%（3/36），两者差异具有显著性（x2 =21.772，P0.0001）。36.1%的成熟T细胞肿瘤组有3项或4项全T抗原强度变化（13/36），明显高于对照组的8.3%（3/36）。两者差异具有显著性（x2 =6.525，P=0.0106）。97.2%的成熟T细胞肿瘤CD4/CD8比例异常（35/36），明显高于对照组的22.2%（8/36），两者差异具有显著性（x2 =39.024，P0.0001）。27.8%的成熟T细胞肿瘤 CD45表达异常（10/36），明显高于对照组的2.8%（1/36），两者差异具有显著性（x2 =6.859，P0.0088）。结论 成熟T细胞肿瘤与反应性T细胞在全T 细胞抗原、CD4、CD8及CD45表达方面具有明显不同的特点，上述抗体的检测有助于成熟T细胞肿瘤的诊断及鉴别诊断。关键词 T细胞肿瘤，成熟T；反应性T细胞；抗原表达；诊断Comparison of Antigen Expression of Mature T Cell Neoplasm and Reactive T cells CHEN Hong-mei*, QI Man, XIA Cheng-qing, CHEN hang, XIN ya-wen, et al. *Department of Pathology Hangzhou Adicon Clinical Laboratories, Hangzhou 310023 ChinaCorresponding author：XIA Cheng-qingAbstract Aim To explore the value of detection of leucocyte common antigen CD45, pan-T cell CD2,CD3,CD5,CD7 and T cell subsets antigen CD4 and CD8 in the diagnosis of mature T cell neoplasm by Comparing the expression profile of above antigens in mature T cell neoplasm and reactive T cells. Method Thirty six cases of mature T-cell neoplasm and 36 non mature T cell neoplasm patients with multiparameter flow immunophenotye were retrospectively analyzed. The expression pattern of antigens was classified as loss of antigen, and abnormal intensity of antigen expression including down regulation, up regulation, bimodal and heterogeneity. Results 63.9% of mature T cell neoplasm lost one or more pan-T antigens (23/36) , while only 8.3% cases of control group lost 1 pan-T antigen (3/36) ,the difference reached statistic significant（x2 =21.772，P0.0106）. 36.1% of mature T cell neoplasm showing 3 or 4 abnormal intensity of pan-T antigens (16/36) , while only 8.3% of control cases showing 3 or 4 abnormal intensity of pan-T antigens (3/36) . The difference reached statistic significant（x2 =6.525，P0.0001）. Abnormal CD4/CD8 ratio was detected in 97.2% of mature T cell neoplasm showing (35/36) , however only 22.2% of control cases showing abnormal CD4/CD8 ratio (3/36) （x2 =39.024，P0.0001）. The percentage of mature T cell neoplasm showing abnormal expression of CD45 was significant higher than that of control group（27.8% vs 2.8% ;x2 =6.859，P0.0088）Conclussion Mature T cell neoplasm is different from reactive T cells in expression of pan-T antigen，CD4,CD8 and CD45. Detection of above antigen expression is helpful in the diagnosis of mature T cell neoplasm.Key words mature T cell neoplasm； Reactive T cells, ；Immunophenotyping ；Diagnosis 免疫表型分析常被用来确定异常增生的淋巴细胞的系来源，确定B细胞是否为克隆性增生亦或肿瘤性增生，在B细胞肿瘤诊断及分型方面具有重要意义1, 2 。由于通过免疫表型确定T细胞是否为克隆性增生比较复杂，目前主要限于研究领域3-5，未能广泛应用于临床。免疫组织化学染色通常采用单参数来确定淋巴组织的抗原表达情况，该技术可以检测到抗原丢失、T细胞亚群限制性增生、同时表达或不表达CD4、CD8等明显的抗原表达异常情况，但不能反映抗原表达的微细变化如抗原表达增强、抗原表达减弱、抗原表达不均匀等6。另外，多数成熟T细胞肿瘤中存在大量反应性增生的淋巴细胞，使单参数免疫组织化学染色结果的判断更加复杂6。多参数流式细胞技术的发展，不仅使得抗原丢失等检测更加容易，同时也使得检测抗原表达的微细变化成为可能，从而为T细胞肿瘤的诊断提供更多信息。本文对33例成熟T细胞肿瘤白细胞共同抗原CD45， 全T 细胞抗原CD2、CD3、CD5、CD7以及CD4、CD8两种T细胞亚群相关抗原的表达进行回顾性分析，探讨上述抗原在成熟T细胞肿瘤中的变化规律，为T 细胞肿瘤的诊断提供参考。材料和方法1.1病例来源：36例成T细胞肿瘤为首都医科大学附属北京朝阳医院2000年12月至2008年12月及杭州艾迪康医学检验中心病理实验室2008年4月-2011年8月收集病例，其中淋巴结活检8例，皮肤活检1例，骨髓标本22例、外周血5例。淋巴结活检及皮肤活检标本均进行常规石蜡切片、H&E染色、免疫组织化学染色及流式细胞免疫分型。骨髓及外周血均行流式细胞免疫分型及细胞涂片形态学观察，其中4例骨髓标本行TCR 重排，结果显示克隆性重排阳性。根据2008 WHO分类标准进行分类。 对照组为36例非T细胞肿瘤的白血病及感染病例，其性别与年龄构成与成熟T细胞肿瘤组相似。1.2流式细胞检测：活检组织先制备单细胞悬液2。取新鲜活检组织，用一次性切片刀片将其切成薄片（尽量切薄），取5-10片（如标本较小可适当多切几片）放入PBS缓冲液中用移液器反复轻轻抽吸制备细胞悬液，1000转/分离心3分钟，去上清，加入PBS将细胞浓度调到1106/ml备用。对单细胞悬液、骨髓、外周血进行常规3色或4色标记，每例均包括但不限于CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等抗体。有上述抗原丢失的标本再行CD2、CD3、CD5、CD7四色标记。荧光标记抗体及流式细胞仪均为美国BECKMAN COULTER公司产品。检测时FS（Forward Scatter，前向散射光）采用线性放大，SS（Side Scatter，侧向散射光）、荧光信号采用对数放大，每管样本至少收集10 000个细胞。1.3 流式细胞免疫表型结果判断：根据抗原表达及其与残留正常T 细胞的比较，将抗原表达模式分为丢失（或阴性，简称阴性）（图1）、表达正常（简称正常）及抗原表达强度异常，包括表达减弱（简称减弱）、表达增强（简称增强）（图2）、双峰表达（部分阳性、部分阴性，或部分弱阳性、部分强阳性简称双峰）（图3）、表达不均匀（为阳性表达，但表达强度不均匀。简称不均）等。CD4/CD8比值介于0.53.0 视为CD4、CD8表达正常，CD4/CD8比值3.0，以及双阳性和双阴性均视为异常。1.4 统计数据采用Medcalc软件处理，两组率的比较采用x2检验，P0.05 被认为具有统计学意义2. 结果2.1 36例外周T细胞淋巴瘤病例中，男23例，女13例，年龄最大93岁，最小28岁， 平均56.5岁。其中血管免疫母细胞性淋巴瘤5例（2例为淋巴结标本，2例为骨髓标本，1例为外周血），外周T细胞淋巴瘤，非特殊型24例（4例为淋巴结标本，17例为骨髓标本，3例为外周血），T幼淋巴细胞性白血病2例（骨髓标本）、间变性大T细胞淋巴瘤2例（淋巴结），皮肤蕈样霉菌病1例（皮肤活检标本）。大颗粒T淋巴细胞白血病2例（外周血及骨髓各1例）。2.2 全T细胞抗原CD2、CD3、CD5、CD7的表达情况2.2.1 抗原表达丢失情况36例成熟T细胞肿瘤中23例存在抗原丢失，占63.9%，其中丢失1项、2项、3项的分别为16、6、1例，没有丢失4项病例。抗原丢失中以CD7丢失最多有13例，其次为CD5，有8例，CD2、CD3分别为5例和1例。对照组仅2例丢失CD7，1例丢失CD5，没有丢失2项及以上的病例。两组抗原丢失差异具有非常显著性（x2 =21.772，P0.0001）（表1）。2.2.2 两组全T抗原表达强度变化见表2。成熟T细胞肿瘤组有1项或2项抗原表达强度改变的共16例，对照组为25例，分别占44.4%及69.4%，差异无显著性（x2=3.625, p=0.0569）。3项或4项抗原强度变化的，两组分别有13例和3例，占比分别为36.1%和8.3%。两者差异具有显著性（x2 =6.525，P=0.0106）。2.3 CD4、CD8表达情况：成熟T细胞肿瘤组，CD4、CD8 表达异常的35例，占97.2%，其中双阳性2例，双阴性2例。仅1例CD4/CD8比值正常；对照组表达异常的8例，占22.2%，无双阳性及双阴性病例。两组CD4、CD8表达异常差异具有非常显著性（x2= 39.024，p0.0001）。2.4 白细胞共同抗原CD45表达：36例成熟T细胞肿瘤中，26例肿瘤细胞CD45表达强度与残留T细胞相当，10例CD45表达异常，占27.8%。其中4例表达减弱， 4例表达不均，2例表达丢失。对照组，除1例CD45表达不均外，CD45表达均正常，异常率为2.8%，两组差异具有显著性（x2= 6.859，p=0.0088）。3. 讨论 流式细胞免疫分型以其快捷、能进行多参数分析及对抗原的表达进行定量分析等优点在淋巴瘤的诊断及分型中得到广泛应用2,6，特别是在小细胞性B细胞淋巴瘤的诊断及分型上具有重要价值。流式细胞术诊断B细胞淋巴瘤的关键是对单克隆性增生的判断，即免疫球蛋白轻链限制性表达的判断。由于目前没有简单可靠的判断T细胞克隆性增生的指标3-5， 流式细胞免疫分型对T细胞淋巴溜/白血病的诊断则主要依靠抗原表达的异常及散射光的改变来判断3-6。正常情况下成熟T细胞表达CD2、CD3、CD5、CD7，因此这些抗原被称为全T细胞抗原。全T细胞抗原表达异常是成熟T细胞肿瘤的常见现象6-9。全T细胞抗原表达异常可表现为抗原表达增强、抗原表达减弱、抗原表达不均匀、抗原表达丢失及双峰表达等。本项目对36例成熟T细胞肿瘤全T细胞抗原CD2、CD3、CD5及CD7的表达进行分析，并与非T细胞肿瘤中反应性T细胞抗原表达进行比较。结果显示36例成熟T细胞肿瘤中，23例存在抗原丢失，占63.9%，其中丢失1项、2项、3项分别为16、6、1例。CD7丢失最多为13例，其余依次为CD5 、CD2、CD3, 分别为8例、5例和1例。而对照组仅2例丢失CD7，1例丢失CD5，其余33例均无抗原丢失，抗原丢失病例占8.3%。两组差异具有显著性（x2 =12.51，P=0.0004）。上述表明，如果全T抗原丢失达2个或2个以上，应高度怀疑T细胞肿瘤。除抗原丢失外，对照组与成熟T细胞肿瘤组均有全T抗原表达强度的改变，但两组抗原表达丢失情况不同。成熟T细胞肿瘤组抗原表达强度变化达3项及3项以上的比例明显高于对照组（36.1%和8.3%），其差异具有显著性（x2 =6.525，P=0.0106）。提示如果全T细胞抗原变化达到3个或4个，成熟T细胞肿瘤可能性增大，诊断时应首先考虑肿瘤。但应和一些非肿瘤性疾病鉴别10。与文献6-9, 11相比，本组全T细胞抗原表达异常比例较高，除了所选肿瘤的种类不同外，与分析方法不同有关。和文献6-10不同，作者将抗原表达不均与及双峰表达也纳入抗原表达异常，因而提高了抗原表达异常的检出率。 CD45是白细胞共同抗原，淋巴母细胞阶段表达较弱，正常成熟T细胞表达较强，因此在淋巴母细胞白血病中CD45常弱表达12。但关于其在成熟T细胞中的表达没有具体的统计数据。36例成熟T细胞肿瘤中有10例CD45表达异常，占27.8%，其中4例表达减弱，4例表达不均，表达丢失2例。与肿瘤组不同，对照组T 细胞CD45 除1例表达不均外，其余35例表达均正常。因此当外周T细胞CD45强度表达改变，特别是丢失时，应考虑T肿瘤的可能性。值得强调的是，本组病例中有2例CD45丢失，因此在应用免疫组织化学染色作肿瘤的鉴别诊断时，不要因为CD45阴性就排除淋巴组织增生性肿瘤的可能，这时CD43染色不失为很好的选择。 CD4与CD8的表达模式对诊断T细胞肿瘤非常重要，一般情况下，限制性表达CD4或者CD8，CD4与CD8双阴性，CD4与CD8双阳性等提示T细胞肿瘤可能性大13。本组36例成熟T细胞肿瘤中仅1例CD4/CD8比例正常，因此CD4/CD8比例正常的病例诊断T细胞肿瘤应十分小心。相反，对照组中22.2%（8/36）的病例CD4/CD8比例异常，因此CD4/CD8比例异常并不都是T细胞肿瘤。一些非T细胞肿瘤和一些病毒感染引起的反应性病变10可表现为以CD4+细胞占显著优势或CD8阳性细胞占显著优势，甚至是限制性表达CD4或者CD8。当然CD4/CD8比例正常并不能排除成熟T细胞肿瘤的可能。一些成熟T细胞肿瘤由于混有大量反应性T细胞，其CD4/CD8比例可以正常13，因此不能单纯根据CD4/CD8的比例来判断T细胞是否为肿瘤性增生。综上述，成熟T细胞肿瘤CD45、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等表达与反应性T细胞存在明显差异，其中全T细胞抗原丢失达到2项，表达强度变化达到3项，以及CD45丢失等均应高度怀疑淋巴瘤的可能。CD4/CD8异常，对鉴别成熟T细胞肿瘤与反应性T细胞具有参考意义，特别是CD4/CD8比例正常时，诊断T细胞肿瘤应十分小心。当然上述抗原表达正常，也不能排除T细胞肿瘤的可能，其诊断要充分结合临床及形态学，必要时还得参考T 细胞受体重排检查结果。参考文献1. 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