粘细菌的分离筛选及其应用研究.doc

粘细菌的分离筛选及其应用研究09生工（2）班 肖军 20090806249摘要：由于粘细菌自身生长特性的限制，分离纯化的困难和耗时极大地限制了菌种资源的开发。该文简要介绍了粘细菌的生物生理学特性，探讨了基于纯培养技术筛选粘细菌的常用方法，以及运用宏基因组技术来获得未培养或无子实体克隆菌株的流程，指出了当前在菌种筛选方面存在的主要问题，对进一步的研究开发给出了一些见解，并展望了其在医药、农业、生态环境和工业生产中的应用前景，使粘细菌得到更多研究者的重视，弥补其应用研究的不足。关键字：粘细菌；分离；纯化；应用；前景粘细菌(Myxobacteria)是典型的革兰氏阴性菌，属滑动细菌，营养细胞呈杆状柔软，具有独特的信号传递系统和形态发生过程，通过信号的传递和感应聚集形成子实体(FruitingBodies)，可作为研究原核生物多细胞行为和形态发生的重要模式材料。因其代谢产物丰富，作用机制多样等特点，已经成为生物活性次级代谢产物的“微工厂”，越来越受到罔内外研究者的高度关注。但是由于粘细菌自身特性的限制、分离纯化的困难和方法的特殊性使其成为制约研究、开发粘细菌的一个瓶颈，目前已知的粘细菌大多是用传统方法分离的，基于此，笔者对粘细菌常用的筛选方法作一归纳总结，同时探讨了运用宏基因组技术来获得未培养或无子实体粘细菌的流程，此方面国内相关文献报道较少，并展望了其应用前景，为更多的研究人员来开发应用粘细菌提供一种思路和方法，使粘细菌得到应有的重视。1 特性简介11 生长分布粘细菌作为土壤中的常见腐生菌为严格好氧的化能有机营养璎微牛物，通常撮的土样可以分离出4、5种，一般在温暖十燥富含有机质的土壤中尤为丰富，最适生长温度在30左右，主要分布于土壤表层、树皮、腐烂的木材、厩肥和动物粪便上，尤其是草食性动物的粪便、中性或微碱性的土壤、活树树皮以及腐败的植物上。由于枯细菌的粘孢子和子实体有很强的抗逆性，在海洋、酸性泥沼、低氧条件、高渗透压、盐碱等极端条件下也有粘细菌的分布。 12系统分类从细菌分类已确定的粘细菌有12个属，约40个种。根据对底物的利用能力将其划分为两个生理亚群：溶细菌群和溶纤维索群。其中溶纤维素群所包括的种属较少，只有纤维堆囊菌，其余种属归于溶细菌群。目前粘细菌是以其形态特征为主要依据进行划分的，如子实体的结构特征、营养细胞、粘孢子和菌落的形态等，同时辅助于生理生化实验、G+C百分含量、脂肪酸的类型等，近年来分子鉴定的方法也运用其中。 13生理生化粘细菌产生的胞外酶能水解蛋自质、核酸、死菌体和纤维素等多种物质以氨基酸或小分子肽类提供营养，为特征性菌落的形成创造条件。溶纤维素群采用滤纸来诱导子实体的形成，在生理生化实验中能分解纤维素，其余指标不尽相同，溶细菌群以死的大肠杆菌或酵母菌为诱导物来形成子实体进行富集，各种生理指标不尽相同。同时菌株也可以分泌丰富的胞外黏液多糖，有螳还能产生类胡萝卜素(尤其是叔糖苷类)、原仆啉和黑色素，这些特征也为我们提供了较好的研究方向。 14几大性状粘细菌有几个突出特征：(1)可以通过底物诱导形成子实体。在水琼脂等营养匮乏的培养摹上，细胞聚集堆积形成子实体需要一定的密度依赖性，通常浓度要达到103 cfuml以上，同时生长周期较长，容易被碡菌污染，形成的子实体颜色和形状随菌种而异，但经常是红、黄等鲜艳的颜色；(2)菌体能向体外分泌多糖黏液将细胞团包埋于黏液中，在液体培养基中分散难，借助于黏液在圃体界面上作滑行运动。町形成薄而扩展的菌落；(3)细胞DNA中含有较高的G+c(67一7l)；(4)町以产生丰富的牛物活性物质，如抗肿瘤哺1、抗凝溶栓蛋白、谷胱甘肽转移酶和乙酰月H碱酯酶的抑制剂|71等，这为寻找新药或新药先导化合物提供了较好的菌种资源。2筛选方法 21 基于纯培养的粘细菌传统筛选方法由于粘细菌独特的生长特性，使用传统的稀释培养方法来分离纯化已不能凑效。分离纯化粘细菌的主要依据：(I)菌体在特定底物诱导条件F nr聚集形成子实体；(2)在营养匮乏的培养g-上容易形成薄而扩展的菌落，形态各异，有滑动痕迹并分泌黏液；(3)菌体细胞在营养丰富的液体培养基中振荡培养时很难分散，通常在试管中会形成球块状沉淀或薄膜片状。 211样品预处理将采集回来的不同环境下的土壤样品室内自然风干后磨成粉末，枯枝败叶类样品磨碎，用时用一定浓度的放线荫酮、制霉菌素或多菌灵。浸泡数小时，以除去一些杂菌，食草动物的粪便也用同样浓度的试剂浸泡后再用高压蒸汽火菌。 212富集分离：(1)溶细菌群粘细菌的富集：菌体诱导法，在YWCX或EWCX培养基上的菌体交叉点上接种一个适当大小的样品。也可以将活菌体点种于WCX平板，在这些点上接种适量样品。(2)溶纤维素群粘细菌的富集：纤维索诱导法。将适虽样品均匀撒在铺有一层灭菌滤纸的CNST、ST21或ISCX培养基上进行培养。(3)综合富集：wcx粪粒诱导法，由于草食动物的粪粒几乎是所有粘细菌生长的良好基质可以同时对溶细菌和溶纤维素类群的粘细菌进行富集分离，将预处理后的样品均匀撒在半埋入WCX培养基的灭菌粪粒上或直接将粪粒埋人盛有土样的平皿中培养此方法主要是诱导土壤中的粘细菌；WCX诱导，将处理后的适量样品直接加剑WCX上富集。 213纯化方法：(1)直接纯化：将诱导出的子实体头部或特征性菌落边缘直接接种于上述相应培养基上培养观察，其中溶纤维素群使用纤维素粉或可溶性纤维素替代滤纸，观察菌落是否产生滑动现象、有元黏液、子实体是否明显、有无纤维索分解现象等。通过此方法得到纯培养的菌种较少，时间较短，大部分的菌株还需要复杂的间接纯化。（2)问接纯化：此方法比较耗时，需要反复处理多次，尤其是在抗生素处理时需要摸索抗生素的浓度、添加种类等是否对目的菌株也产生了抑制作用。加热处理：挑取子实体于盛有无菌水的试管中，58一60水浴l0一20 min，以除去不耐热的杂菌。低温处理：将子实体置于一80冰箱冷冻24h。取出后转接，反复23次，除去可能存在的蠕虫以及不耐反复冻融的细菌。抗生索处理：将子实体转接到加有一定浓度混合抗生素的纯化平板上培养，若出现扩展菌膜，则尽早从边缘挑取，转接至新鲜培养基上继续培养。(3)将综合富集的菌株在WCX或VY2平板上直接纯化由于非纤维索降解粘细菌也可能利用纤维素降解菌的分解产物而次生生长，在进一步纯化时，在富集溶纤维素群粘细菌平板上生长的菌应分别接种筛选溶细菌群和溶纤维素群的培养基或利用纤维素分解试验进一步鉴定。 214验纯方法：验纯是粘细菌筛选中必不可少的一个操作步骤，普通细菌在分离纯化后直接观察有元单菌落即可，而粘细菌需要固体平板观察尤其是通过液体振荡培养加以确认。(1)同体平板：将纯化后的粘细菌转接至VY2固体平板上，粘细菌町以在其一I-形成薄而扩展的特征性菌落，有滑动痕迹并分泌黏液，观察有无杂菌生长。(2)液体试管：挑取纯化的菌落接种于装有LB、CAS或EBS液体培养基试管中，30、160 rmin振荡培养过夜，观察培养液是否混浊。由于粘细菌在上述培养基中不分散生长，呈块状或薄膜状，培养液振荡过夜后浑浊则认为仍有杂菌，需进一步纯化，澄清即可认为已获得纯培养。 215保存(I)短期保存：平常使用的菌株可以采用VY2斜面或平板培养物保藏。(2)长期保存：可以采用风干的子实体室温保藏；返接兔粪保存”：将纯化菌株在火过荫的兔粪上诱导出子实体，将子实体连同兔粪一并放入菌种保藏管，于干燥器中保存。这两种保存方法在其它细菌中很少见到。 216镜检：由于枯细菌在纯化后的传代培养过程中很快会失去形成子实体的能力，而且不同培养基上子实体形态也会改变，则在整个筛选过程中，要配合使用立体解剖镜、相差显微镜和电镜及时对粘细菌的形态和子实体的形成过程进行追踪观察。张利平“1等对传统筛选方法进行了改进，通过在WCX培养基中添加一定浓度的结晶紫，以抑制荸兰氏阳性菌的干扰，通过兔粪去诱导土壤中丰富的粘细菌的子实体，及时挑取扩展菌落边缘置于CEH培养基中进行验纯，将纯化后的子实体转接兔粪真空保藏也较快的分离到了目的菌株。 22基于宏基因组技术对粘细菌的筛选由于粘细菌纯培养物主要是基于子实体的形成筛选得到的，但同时在分离纯化的过程中有易污染、耗时多等困难以及子实体形态的小稳定性，可以运用宏基因组(metagenomics)技术对粘细菌加以研究，以期获得不可培养或无子实体的菌株，同时可以丰富粘细菌的种类，增加对其多样性、结构和功能的认识，找出粘细菌与环境中其它微生物共同合作机制和进化关系等，从而拓宽对粘细菌的认识。3前景展望粘细菌是一类研究较少、亟待开发的微生物资源菌种，具有诱人的应用前景。为了充分合理的利用粘细菌资源，应该主要从以下几个方面进行着手： 31 充分利用现有的粘细菌资源采用物理、化学和生物的方法对已筛选到的菌种进行选育，试图得到性能稳定的高产菌株；加深对粘细菌信号传递机制和形态发生过程的认识，不断完善系统发育分类；改进代谢产物的提取纯化方法，以提高产量；建立新的筛选模型和方法，获得新活性菌株；利用高通量(HTS)、高内涵(HCS)的筛选方法，提高筛选效率；综合运用基因组学、代谢组学及组合生物合成的方法对现有的菌株进行重组改造，以期获得新的高活性化合物或已知化合物的衍生物。 32扩大粘细菌筛选范围对不同粘细菌分类群进行筛选，争取在粘细菌的筛选、培养方面有所突破，得到高压、盐碱等极端环境下新菌株，分离纯化到新的活性物质；运用宏基因组学技术加大对粘细菌的筛选，以期获得不可培养的菌株，进而发现编码新功能的基凶结构，增加对粘细菌多样性的认识。 33扩大应用范围(1)医学方面：粘细菌的生物活性物质主要应用于抗肿瘤、抗寄生虫、抗病毒等药物的研制。其中最引人瞩目的是抗癌新药埃博霉素(Epothilone)的上市，它具有类似紫杉醇微管蛋白聚合和微管稳定的作用，比紫杉醇具有更好的水溶性，分子量小，对耐紫杉醇类的肿瘤细胞(如乳腺癌、直肠癌等)具有高活性，具有广阔的应用前景，给癌症患者带来了福音，但是其产量低，价格昂贵，进一步限制了临床上的广泛应用。下一步的研究重点在于通过各种方法提高其产量，降低成本，通过后期结构修饰进一步减小毒性等；由于纤维堆囊菌子实体提取物为实际无毒物质，未显示有遗传毒性作用，以粘细菌的子实体或其浸提物为主要原料制备成药物，充分发挥其子实体的降血糖、抗肿瘤、增强免疫力等方面的作用；同时粘细菌也可分泌胞外多糖、类胡萝卜、活性蛋白等，这些都具有较好的医学应用价值。(2) 农业方面：粘细菌的许多次级代谢产物表现为较强的抗真菌活性，具有开发成农用抗生素的潜力，如杀菌剂、除草剂等，使其在农业上得到广泛应用。(3)生态环境：粘细菌能够通过直接接触藻细胞，而使藻细胞裂解，这一特点便于结合其它物理、化学和生物的方法来综合治理水华现象，同时也可以起到降解藻毒素的作用；其产生的酶也可以降解黄曲霉毒素Bl的活性；在生长过程中能够分解土壤或腐物粪便中的各种有机物质，起到改良土壤的作用，可考虑将其开发为微生态制剂；对一些有毒重金属离子具有强烈的吸附作用，起到净化环境的作用。(4)工业生产：溶纤维素类粘细菌能够分解纤维素、几丁质、琼脂以及细菌细胞壁之类的复杂基质，具有较高的纤维素酶活力，为将纤维素转化为生物燃料提供了新的选择，对当前世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有重要的意义。由于粘细菌的生长周期较长，不宜将其直接用作发酵菌种，可考虑粘细菌复合酶制剂的生产，配合根霉、曲霉、白腐菌和细菌等菌株共同用于纤维素乙醇的生产。参考文献：1Dworkin MRecent advances in the social and development biology ofthe MyxobacteriaJMicrobiol Revs，1996，60(1)：702Silke CWenzel，Roll MullerMyxobacteriamicrobial factories for theproduction of bioactive secondary metabolitesJMolecular BioSystems，2009，5：5675743李越中，李健，周璐，等我国粘细菌资源的分离与鉴定J微乍物学报，2000，40：6526554Holt J G，Krieg N R，Sneath P H，et a1Bergeys manual of eterminativebacteriologyMNinth edBaltimore：Williams&Wilkins，1994：5155255王大红，陶文沂粘细菌Stigmatella WXNXJB产生抗肿瘤物质的研究J食品与生物技术学报，2010，29(1)：1041096赵晓飞，余蓉，刘冰花，等黏细菌抗凝溶栓双功能蛋白MF一1的纯化及其酶学性