使用核磁共振光谱决定化学结构的另一选择.doc

使用核磁共振光譜決定化學結構的另一選擇碳序法之化學結構決定陳勝智中國醫藥學院 藥物化學研究所摘要： 本文介紹利用核磁共振光譜，如何進行碳碳連結產生化學結構的方法。本法將碳譜與氫譜之各訊號分別由低磁場到高磁場，一一標識序號。根據HMQC，由氫之序號找到碳之序號，將COSY的氫氫偶合相關改為碳碳連結，也將HMBC碳氫遠程偶合相關更改為碳碳遠程連結，最後利用此等連結進行碳碳連結產生化學結構。化學結構建構完成時，核磁共振光譜訊號之歸屬也一起完成。關鍵字：化學結構決定，碳序法，核磁共振光譜。（本文已發表於化學 60, 153-162, 2002）前言核磁共振光譜能提供豐富的化學結構的相關訊息，故在化學結構決定上扮演著很重要的角色。一般，於取得核磁共振光譜後，從譜型或特性訊號之化學位移、偶合常數等，判斷此等資料與化合物之化學結構的關係，並進一步進行歸屬（assignment），確定化合物的化學結構。當然此過程中，還會尋求二維光譜的協助尋找相關（correlation）以及連結（connection）1。換言之，讀譜作業與光譜之使用是一般所熟悉的方法。筆者經由國內軟體公司的介紹，由Spectrum Research, LLT之網站（）下載SpecMan及NMR-SAMS兩套試用版軟體。此二軟體可直接由核磁共振光譜儀之電腦檔案選取光譜訊號資料（peak picking），並產生化合物的化學結構。簡言之，他們是產生化學結構用的簡便軟體。但經過三十天的試用後發現，此二軟體還需要有解讀核磁共振光譜能力的專家協助使用，因二者在選取光譜資料時，需要專家修正他所處理的資料。筆者認為，既然是有經驗者才能使用，已失去選用此二軟體的意義。筆者從其處理資料的過程以及原創者文獻2-5，體會到該軟體是以碳為主體來建構化學結構式，其法可以理解，但後半部因自動化的需求或軟體選取訊號的正確性問題，並且未好好利用HMBC的所有資料，降低產生化學結構的成功機會。筆者認為電腦自動選取資料，速度雖快，但若還需要專家修正，不如一開始就靠人腦做正確且合理的選取訊號，並好好利用HMBC的所有資料做正確的連結，以獲得正確的結果。於是，筆者反覆嘗試並建立以碳為主體，進行碳碳連結產生化學結構式的人為方法，做為使用核磁共振光譜的另一選擇。本法雖較電腦費力，但所費時間不多，卻因隨機應變或因地制宜的作業過程，使結果較為可靠，值得採用。本法先將碳譜的各訊號以阿拉伯數字，由低磁場到高磁場標識序號（ID number）；氫譜也以相同方式標識序號。根據HMQC，由氫之序號找到碳序號，將COSY的氫氫偶合相關改為碳碳連結，也將HMBC之碳氫遠程偶合相關更改為碳碳遠程連結，最後進行碳碳連結產生化學結構。在本法的操作過程中，COSY直接提供明確的碳碳連結，HMBC所提供的碳碳連結是位與位的遠程連結，比較複雜，但因HMBC資料的定位（allocation）效果，每一個碳均有一定的位置，以類似拼字或拼圖遊戲（crossword or jigsaw puzzle）的反覆嘗試即可產生化學結構。化學結構建構完成時，核磁共振光譜訊號之歸屬也一起完成。結構產生的過程是碳碳連結的過程，其功能類似INADEQUATE光譜。本文以brucine為例，敘述本法之化學結構產生過程與結果，同時也提供經驗與建議。光譜之測定本實驗取購自默克公司之brucine 20 mg 溶於0.6毫升CDCl3 中，以300MHz核磁共振光譜儀（Bruker ARX-300）分別測定氫譜、碳譜、DEPT、COSY、HMQC、HMBC等光譜。以上光譜均以內建程式測定，其參數未做特別更改。結果本文以brucine為例，故於獲得brucine的各種光譜之後，使用微軟的Words文書軟體，依下述順序作業來產生brucine之化學結構。採用微軟的Words文書軟體的理由是此軟體相當普遍，且此軟體的上標、下標、文字之著色、表格之網底、欄寬的調整等都很方便。光譜資料表格化表一顯示碳譜、氫譜、DEPT、HMQC、COSY、HMBC等光譜資料表格化的結果。ID欄中的號碼用來代表碳的序號，此號碼將標記於碳原子之右上角做為識別之用。因ID欄的序號由上而下已依序排定，第二欄中的資料是碳譜的化學位移，由低到高磁場，由上而下，數字由大而小逐漸遞減。為避免兩組號碼混淆，氫之序號均冠以#來與碳之序號區別。第三欄的DEPT是依DEPT光譜資料，將該號的碳以一至四級碳表達出來，例如第8及9號碳是三級碳以CH填表，第23號碳是二級碳以CH2填表。比較特別的碳，如2至9號碳是不飽和碳，可以灰色網底區分，以提醒其共通性。第四欄利用HMQC之交叉峰（cross peak），填上碳所接的氫原子訊號之序號。換言之，必須先在氫譜上，從低磁場到高磁場的訊號上一一標識序號，若遇訊號重疊，可參考HMQC於適當化學位移標識序號。例如12號所接的8號氫是用HMQC確定，才補記 #8；第11、16、18、21、23等碳均接二個不同化學位移的氫，也都需要HMQC來協助才填入。HMQC欄還填入各氫的化學位移、氫原子數、偶合常數等資料，用於協助連結，也用於將來氫核訊號之歸屬。其次的COSY欄，是填入1H-1H COSY交叉峰資料的欄位，例如10號碳上的4號氫與21、17、14號氫有偶合關係，所以在該欄位填入#21、#17、#14。另外，COSY的資料，也應適切標示氫氫遠程偶合，本表以L標示。再其次的是連結用的欄位，也是工作區，在此區可先做一點資料分析，方便爾後工作的進行。因基本資料與資料分析有時對工作有決定性的幫助，所以一定要做。最後一欄是HMBC的資料欄，在此可將HMBC的交叉峰一一填入，例如12號碳與#19、#18、#16、#12號氫有2J或3J之遠程偶合關係，就依序填於該欄內。20與21號碳非常接近，其HMBC交叉峰無法區分，只好暫時都填給他們，等連結時再解決。製作本表時，碳之訊號峰應依分子式的碳數做完全確認。HMQC配合DEPT完全解讀後，應檢查碳譜或氫譜序號的正確性，若序號有增減應該重新排序（不方便增加，補以獨立的代號也可）。完全表格化之後，應詳細檢查表上所有資料的正確性，務必正確才能著手碳碳連結，否則無法產生正確的化學結構。碳的總數、氫的總數是否與分子式吻合，若有缺，應補足或註明於基本資料中，原則上寧可多不可少，就算雜訊被誤認而給予編號，也不致影響正確化學結構的產生。根據COSY資料執行碳碳連結並依化學位移接上陰電性原子如表二，COSY欄中氫的號碼已一一轉換為相關的碳碼，所以原本為氫氫偶合已改為碳碳連結。例如6號碳的#3號氫與#13號氫有遠程偶合，對照HMQC欄的資料，知道#13是C22的氫，故C22-C6應有遠程連結，以相同方式可得C11-C6的鄰碳連結。如此即可將氫氫連結改為碳碳連結，C11-C6以-C11H2-C6H-表示，一一列於表三新增的欄位中，並參考化學位移及分子式相關資料，盡量把陰電性原子或雙鍵接上。最後將已確定的各個碳碳連結，以及無連結的四級碳原子，如表三所示依序排於工作區，供進一步連結使用。COSY的交叉峰資料很重要，因其碳碳連結較明確，故被採用於連結後，應做記（著色）以防被拆散。至於HMBC的交叉峰資料，比照上述，把原為碳氫相關的資料轉換成碳碳連結的資料，即獲得碳碳遠程連結資料，並列於新增的相關欄位中。例如C17-C20,23,18,13,8表示碳17與碳20、23、18、13、8有位或位的碳碳連結（C17-C-C）關係。利用已建立的碳碳連結，即可建構化學結構。依HMBC進一步連結要著手碳碳連結產生化學結構之前，應先從一以COSY連結的正確片段開始。選不同的起點進行連結，有不同的難度，也可能有不同的結果。將選定的片段置於HMBC碳碳連結工作區中，開始以HMBC碳碳連結資料進行連結。連結時，從片段中的碳，尋找相關的HMBC連結資料，利用HMBC資料的定位效果，將要連結的碳放置於被HMBC所指定的位置，以類似拼字或拼圖遊戲方式反覆嘗試。故為方便計，可將HMBC資料拷貝於工作區，如表三所示之（C4-C19,23,16,1）（C22-C19,23,16,6）；也為方便反覆檢查（隨個人喜好非必要），可將已用過的HMBC遠程連結資料一一羅列於使用HMBC順序之項下。在完成一個連結之後，才考慮下一個連結。如表四所示，HMBC碳碳連結工作區中的連結是依表四A-E順序完成。表四-A是接續自表三，根據COSY已連結部分之資料，C22H應該連結C19H-C13H-N-及C23H2-C12H-N-。表四-B中，依據HMBC相關，再接C16H2-N-於C4，接-C18H2-C20H2-於N。因C16與C12、C18有HMBC相關，可如表所示，環化產生第一個環。於表四-C中，依COSY資料，C19H應接-C10H-C21H2-，至此已將所有COSY的碳碳連結列入化學結構中。之後，經表四-D至表四-E，把brucine的化學結構產生出來。調整後之化學結構列於同表的最右下，其結構上的數字為碳之序號，依序號可找到碳與氫核的化學位移，故訊號歸屬也一起完成。利用HMBC連結時，很容易出錯，務必使週邊的HMBC關係完全符合；此作業過程中，也務必記得使用以COSY連結的片段。討論筆者檢討本法期間，曾經使用4-methoxy-2,3,7-trihydroxyiso- flavanone、(S)-4-methoxydalbergione、medicarpin、3(R),8-dimethyl2- (R),5-bis(1-methylethyl)-6-oxo-2,3,6,7,9,10-hexahydro-1H-3A,7-ethano-aulene-10-carbonitrile3、alborixin4、betulinic acid5、taxol6等筆者研究所所分離之化合物及文獻之光譜資料，檢討本法的適用性，結果大致均能產生所預期的化學結構，但由於COSY或HMBC交叉峰的不齊全，均發生程度不同的困難，必須以核磁共振光譜之讀譜知識協助，以下就這些經驗或注意事項加以說明。（下載練習用光譜資料）碳序法化學結構決定之基本要求如前述，使用本法必須準備氫譜、碳譜、DEPT、COSY、HMQC、HMBC光譜。但當碳譜解析度好、無重疊，HMQC的交叉峰也齊全無遺失，DEPT光譜是可省略的，不過必須提醒的是，DEPT與HMQC有互補的功能，可幫助檢查訊號有無重疊或錯誤。HMQC光譜則非測不可，因氫氫相關或碳氫相關要轉成碳碳連結必須倚賴HMQC。所準備的光譜，雜訊峰愈少愈好，以保資料的正確。各光譜中，氫譜與碳譜均不能有太多訊號重疊，尤其碳譜最好接近完全解析，若有重疊，必須能由DEPT、HMQC、HMBC讀出。而HMBC的交叉峰愈多愈好，1J峰不予採用，4J峰能不測得最好，若發現可能是4J峰，希望能分辨，以減少困擾。相反地，當COSY與HMBC提供連結交叉峰不足時，本法的執行將會很困難，但所整理的表格化資料對化學結構的決定還是會有幫助的。雖不直接使用，為求作業的順利，也最好準備MS、NOESY及IR光譜，因它們也可能提供協助。事先知道分子式雖非必要，但實際上幫助非常大。這些輔助資料在NMR資料不全時，更顯得重要。碳序法化學結構決定時應注意的一般事項對本法而言，資料正確的表格化很重要，故表格化前後之讀譜與檢查工作應相當謹慎。資料表格化之後，若碳數不足應設法補上，以表一中ID 20與21的碳（C20與C21）為例，假設無法看出是兩個訊號，則可參考氫譜、DEPT及HMQC（本例一個碳訊號4個氫）確定有兩個碳訊號時，應補計一個碳（一訊號峰有20與21兩個號碼）。若不補而致遺漏，則無法產生正確的化學結構。使用DEPT與HMQC確認碳訊號峰時，若四級碳的化學位移與其他級數的碳相同時，實際上有時很難找到此四級碳的訊號，應特別小心。若光譜顯示有單取代苯環，其氫及碳之訊號分別在氫譜及碳譜有重疊時，並不影響結構決定，可不予計較（不必列入編號），結構完成後補上苯環即可。多取代苯環的每一個碳及氫訊號應各別給序號，含苯環在內的化學結構才能產生。雖有COSY藉以連結，但詳細解讀氫譜，並詳列化學位移及偶合常數除幫助連結，也將用於化學結構產生後訊號的歸屬，故表一中有偶合常數等數據的羅列。表一所顯示之COSY的碳碳連結資料，應適切標示遠程偶合，應注意飽和氫與芳香環不飽和氫的遠程偶合的區辨，也應注意自旋系統（spin system），並做資料分析供連結時之參考。雖無決定性的影響，分子有OH基時，最好選用適當或不含水之溶劑測定光譜，期望OH訊號的正確顯示，如此可完全掌握氫的總數及更多的相關。由於四級碳過多，相關資料太少，有時只能連結成片段，最後才將各片段做合理的組合，才產生分子的化學結構。所謂合理的組合，以及前述之隨機應變、因地制宜，正是電腦軟體所難做到的。依化學位移及偶合常數調整相關連結，但必須維持HMBC的合理相關本法所建構的結構中，可能因四級碳放置錯誤導致無法正確歸屬（兩個四級碳倒置化學位移不符），所以應於結構完成後，仔細檢討對化學位移有影響的各因素，確定所有歸屬是否正確。有些碳位置互換也符合HMBC的要求，故HMBC的交叉峰的使用要非常小心，一邊選用一邊考慮各項影響因素的適切性。碳序法化學結構決定之過程中HMBC碳碳連結資料的使用使用HMBC碳碳連結資料的過程中，依經驗，下列各項值得參考：1. 在選定連結工作的起點後，從其碳的HMBC資料一一導入連結。每一個碳的導入連結，先以位處理，其次才考慮位，但位與位交錯嘗試尋求最適化是很重要的過程。HMBC的連結過程中，不要忘記使用已以COSY連結的片段，也應注意不得將確定的片段拆散。COSY連結所得片段上的碳，若無HMBC之相關，可反過來從各四級碳的HMBC碳碳連結資料中尋找相關。選擇不同的片段為起點開始連結，有不同的難度，也可能有不同的結果，故多做幾次的不同起點的連結以尋求合理的化學結構，是有其必要。2. HMBC資料無法提供適當的碳來進行連結時，就同等級的碳中，依化學位移、HMBC等資料選擇最適者進行連結，並以不同顏色標示，以表示還有可能更改。3. 遇連結或安排有困難時，往往需引進四級碳或氮、氧原子，應參考分子式或化學位移進行連結。有時在引進四級碳、氮、氧原子之同時，也考慮是否應予環化（可優先考慮五員環或六員環），有HMBC遠程連結資料支持時更需如此。4. 在執行HMBC連結時，務必做到各HMBC資料的合理兼顧，絕不能將就（堅持所有HMBC的位或位連結是絕對必要）。故試錯（trial and error）的不斷重演是必然的。5. 有些例子，其HMBC光譜有4J資料，雖有增加資料的好處，但有複雜化的缺點，會增加反覆試錯的次數。但連結時遇到似為4J資料（位連結）時，應小心使用，最好也考慮不同的連結，看是否能成為位連結。所完成的結構，經改換或對調可減少位連結而增加位連結，依經驗，其正確性提高。6. 如遇二或三個碳之訊號太接近，因而有兩套或三套HMBC資料混雜時，應設法區分選讀，一般從其附近碳的HMBC可得到區分的訊息。HMBC的訊號太接近時，應盡量以放大的圖譜支援。7. HMBC的使用有其難度，結構完成後應仔細檢討各化學位移。結論電腦輔助決定化學結構（computer-assisted structure elucidation）系統的開發已有一段時日2-5，其目的是希望有朝一日能夠自動化決定化學結構，但實際上已開發的系統都遇到許多困難。而Spectrum Research, LLT 所製作之SpecMan及NMR-SAMS兩套版軟體，筆者認為其所建構的基礎是有相當的說服力，且已相當程度降低對使用者的依賴，算是此領域最可行的系統。但不可諱言的，此二軟體離實用似還有一段距離，因為此二軟體確實還需要使用者的大力協助。所以，筆者才進行碳序法的可用性探討。碳序法化學結構決定，在理論上是一很合理的方法。換言之，只要光譜資料正確、資料齊全，化學結構沒有不產生的理由。所以如何測得正確且資料齊全的光譜，是使用本法之前應該努力的事，若能如此，幾乎不具備讀譜能力者亦能決定化學結構。參考資料1. Sanders, J. K. M.; Hunter, B. K. “Modern NMR spectroscopy: a guide for chemists”, 2nd ed., Oxford University Press: Oxford, 1992.2. Peng, C.; Yuan, S.; Zheng, C., Hui, Y. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1994, 34, 805.3. Peng, C.; Yuan, S.; Zheng, C., Hui, Y., Wu, H., Ma, K. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1994, 34, 814.4. Peng, C.; Yuan, S.; Zheng, C., Shi, Z., Wu, H. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1995, 35, 539.5. Peng, C.; Bodenhausen, G.; Qiu, S.; Fong, H. H. S.; Farnsworth, N. R.; Yuan, S.; Zheng, C. Magn. Reson. Chem. 1998, 36, 267.6. Spectrum Research, LLT所製作SpecMan及NMR-SAMS兩套軟體之教學資料。Another Choice for Structure Elucidation by Using NMR Spectra: Structure Generation by ID Number MethodSheng-Chih ChenGraduate Institute of Pharmaceutical