产葡萄糖氧化酶的筛选.doc

生物工程食品科学2011, Vol. 32, No. 01 149产葡萄糖氧化酶菌株的筛选及发酵培养基的优化摘 要：从土壤中筛选出了一株产葡萄糖氧化酶较高的菌株，利用响应面法对该菌株的产酶培养基进行优化以提高产酶量。响应面法优化的发酵培养基组成为：葡萄糖109.41g/L、复合氮源(m(月示蛋白胨):m(NH4)2SO4)=3:1)37.36g/L、吐温-80 37.15g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO47H2O 0.7g/L 和KCl 0.5g/L。采用该优化培养基所得葡萄糖氧化酶的活力为1.54U/mL，较优化前提高了31.6%。关键词：葡萄糖氧化酶；酶活力；培养基优化；葡萄糖氧化酶(glucose oxidase， GOD)系统名为-D- 葡萄糖氧化还原酶(EC1.1.3.4)。它能专一地将-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢1。葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用2。在食品工业中，葡萄糖氧化酶可用于除去食品中的葡萄糖，从而防止食品发生褐变或获得纯度较高的低聚糖3-4；可脱掉食品中的氧，以达到改善食品品质、延长食品货架期的目的；作为面粉改良剂溴酸钾的替代品，用作一种更为安全的面粉改良剂 5 。在发酵工业中，葡萄糖氧化酶的催化产物为葡萄糖酸，可用于生产葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等。葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体在微生物中主要是黑曲霉和青霉属菌株。目前我国生产的工业酶制剂纯度普遍较低，长期以来依赖进口，因此寻找进口酶制剂的替代产品具有重要意义。响应面法可同时对影响生物产量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价6，因此它可快速有效地确定多因子系统的最佳条件，该法已经广泛应用于各类培养基以及发酵条件的优化7-9。为了提高微生物产酶量，罗斌等10利用响应面法优化了乳酸杆菌产- 氨基丁酸的培养条件，提高了目的产物的生产量；Aghaie 等11利用响应面法优化了黑曲霉产有机酸的发酵条件，经过发酵条件的优化提高了有机酸的产量。本实验从土壤中进行高产葡萄糖氧化酶菌株的筛选，在此基础上利用响应面法对发酵培养基进行优化，以提高葡萄糖氧化酶的产量。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土壤样品的采集采样地点：福州文武雪峰农场；采样部位和深度：取样深度为010cm；采样季节为秋季；采样方法、数量：采用多点混合土样采集方法，每个混合土样由20 个样点组成，每个点的取土深度及质量均匀一致，每个混合样品取0 . 1 k g ，对采集样品进行编号待用。1.1.2 培养基平板分离培养基：底层培养基：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、(NH4)2HPO4 0.388g/L、KH2PO4 0.188g/L、MgSO47H2O 0.156g/L、CaCO3 3.5g/L、琼脂20g/L；上层培养基：葡萄糖8 0 g /L、可溶性淀粉1 0g /L、KI1.7g/L、去氧胆酸钠0.2g/L、磷酸缓冲液0.1mol/L、琼脂20g/L，pH5.6。种子培养基：NaNO3 2g/L、K2HPO41g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4 0.01g/L、蔗糖30g/L、琼脂20g/L。发酵培养基：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO47H2O 0.7g/L、KCl 0.5g/L。1.2 方法1.2.1 高产葡萄糖氧化酶菌株的初筛根据Fiedure 显色法12，称取10g 采集来的土壤样品于经过灭菌(121、20min)处理的装有100mL 生理盐水且含有玻璃珠的250mL 锥形瓶中振荡30min。然后用无菌水稀释成10-4、10-5 两个稀释度，分别用移液器吸取0.1mL涂布于预先配制并且灭菌的分离培养基中，28培养3d 后置于5冰箱中静置2d，然后在室温下存放至出现蓝色颜色圈。选取颜色圈中的菌株接种到种子培养基的斜面上培养。1.2.2 高产葡萄糖氧化酶菌株的复筛将初筛得到的斜面转接种于含有发酵培养基的摇瓶中继续培养5 d ，测定发酵液的酶活力。1.2.3 粗酶液制备将上述筛选出来的菌株接种于(孢子浓度104 个/mL)发酵培养基中，于3 0 恒温摇床培养5 d ，摇床转速30 0r/min。发酵完毕后纱布过滤，菌丝体经研磨，磷酸钾缓冲溶液(50mmol/L，pH6.5)浸酶，得粗酶液。1.2.4 酶活力的测定葡萄糖氧化酶的酶活力测定采用郭晓贤等 1 3 的方法。取250mL 三角瓶，加入2% 葡萄糖磷酸缓冲液( pH5.6) 25mL 及1mL 粗酶液，立即于29振荡lh，然后加入0.1mol/L NaOH 溶液 20mL 以终止反应，用0.1mol/L盐酸滴定剩余的NaOH，记录所消耗的盐酸体积(V0)；对照样在加酶液之前加入0.1mol/L NaOH溶液20mL，不必振荡，其他操作相同，记录所消耗的盐酸体积(V1)。酶活力单位定义：在上述实验条件下，每分钟催化氧化1mol 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位( U) 。计算公式为：GOD 酶活力=(V1 V0) n c 1000/60式中：c 为盐酸浓度(0.1mol/L)；n 为稀释倍数。1.2.5 Box-Behnken 响应面设计通过单因素试验结果确定三因素三水平的中心组合试验。拟合出一个二次多项式方程。该方程为描述响应变量与自变量的经验模型，对于三因素系统，模型可表述为9-11：Y=b0+b 1X1+b2X2+b 3X3+b 11X12+b12X1X2+b 13X1X3+b22X22+b23X2X3+b33X3式中：X1、X2、X3 为由部分因素试验确定对响应值影响显著的3 种培养基组分的质量浓度/(g/L)；Y 为预测响应值，b 0 、b 1 、b 2 、b 3 、b 1 1 、b 1 2 、b 1 3 、b 2 2 、b23、b33 为方程系数。用软件Design-Expert 7.1.3 对试验数据进行回归分析，其中回归系数的显著性用F 检验，方程的拟合性由确定系数R 2 确定。1.2.6 模型验证对拟合得到的多元函数进行简单的性状分析便可确定出其极值点以及取得极值的相应自变量的取值。再按照计算所得到的参数进行实验，以验证模型的可靠性，并确定最后的优化结果。2 结果与分析2.1 高产葡萄糖氧化酶菌株的筛选土壤是微生物的重要来源之一，经过对在不同地点取得的60 个土样进行初筛和复筛得到23 株具有产葡萄糖氧化酶能力的菌株，其酶活力如表1 所示。挑选所产酶活力最高的一株进行后续实验，经过镜检观察其形态，发现它是一株霉菌，其孢子颜色为黑色，菌丝有隔，经鉴定其为黑曲霉，测得其酶活力为1.17U/mL。2.2 葡萄糖质量浓度对产酶的影响菌株编号酶活力/(U/mL) 菌株编号酶活力/(U/mL)GOD-1 0.26 0.02 GOD-13 0.78 0.06 GOD-2 0.96 0.05 GOD-14 0.69 0.06GOD-3 0.83 0.05 GOD-15 0.75 0.07 GOD-4 0.62 0.03 GOD-16 0.86 0.07GOD-5 0.56 0.04 GOD-17 0.55 0.04 GOD-6 0.14 0.01 GOD-18 0.16 0.02GOD-7 1.17 0.09 GOD-19 0.73 0.06 GOD-8 0.33 0.02 GOD-20 0.24 0.02GOD-9 0.39 0.03 GOD-21 0.44 0.03 GOD-10 0.46 0.02 GOD-22 0.51 0.04GOD-11 0.52 0.03 GOD-23 0.58 0.05 GOD-12 0.63 0.05表1 土样中分离菌株的酶活力碳源对微生物的生长和产酶有重要影响，郭晓贤等 1 3 分别以蔗糖、葡萄糖、淀粉、乳糖、可溶性淀粉和麦麸作为碳源，研究这些碳源对黑曲霉产葡萄糖氧化酶的影响，研究结果表明葡萄糖对黑曲霉产葡萄糖氧化酶的效果最佳。本实验考虑到葡萄糖既能作为发酵的碳源和能源物质，又能作为葡萄糖氧化酶产生的诱导物，因此直接研究葡萄糖质量浓度对产酶的影响。葡萄糖分别按照质量浓度40、60、80、100、120、140g/L添加到发酵培养基中，测定粗酶液酶活力，结果见表2。在葡萄糖质量浓度为100g/L 时，发酵液的酶活力最高，这可能是由于葡萄糖质量浓度在高于100g/L 时，出现了葡萄糖效应所产生的抑制现象，而当葡萄糖质量浓度低于100g/L 时，葡萄糖的含量又不足以满足菌体生长以及产酶所需要的能源和碳源。2.3 氮源种类及质量浓度对产酶的影响张婷等14分别研究了有机氮源和无机氮源对黑曲霉产葡萄糖氧化酶的影响，在其研究中有机氮源选用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、月示蛋白胨和胰蛋白胨，无机氮源选用(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2HPO4 和(NH4)2S3O8，研究结果表明在有机氮源中，月示蛋白胨对黑曲霉产葡萄糖氧化酶的促进效果最理想。在无机氮源中，(NH4)2SO4 对产酶的促进效果最明显。而郭晓贤等13的研究结果表明，与单一的有机氮源和无机氮源相比，将有机氮源和无机氮源以一定的比例联合使用作为培养基的复合氮源效果最佳。基于上述研究结果，本实验研究有机氮源(月示蛋白胨)和无机氮源(NH4)2SO4)的比例及最适添加量，结果如表3 、4 所示。根据表中实验结果在后续响应面试验中选择m(月示蛋白胨): m(NH4)2SO4)为3:1，复合氮源质量浓度为35g/L 左右进行研究。葡萄糖质量浓度/(g/L) 40 60 80 100 120 140酶活力/(U/mL) 0.86 0.06 0.97 0.06 1.18 0.08 1.27 0.09 0.91 0.05 0.87 0.04表2 葡萄糖质量浓度对酶活力的影响Table 2 Effect of glucose concentration on enzyme activitym(月示蛋白胨):m(NH4)2SO4) 1:1 2:1 3:1 4:1酶活力/(U/mL) 1.19 0.09 1.21 0.08 1.26 0.07 1.23 0.06表3 氮源比例对酶活力的影响Table 3 Effect of ratio between two nitrogen sources on enzyme activity复合氮源质量浓度/(g/L) 20 25 30 35 40 45酶活力/(U/mL) 0.87 0.07 0.97 0.07 1.25 0.08 1.27 0.07 1.27 0.09 1.27 0.08表4 复合氮源质量浓度对酶活力的影响Table 4 Effect of complex nitrogen source concentration on enzyme activity吐温-80 质量浓度/(g/L) 10 20 30 40酶活力/(U/mL) 1.19 0.08 1.22 0.07 1.30 0.09 1.23 0.06表5 吐温-80 质量浓度对酶活力的影响Table 5 Effect of Tween-80 concentration on enzyme activity38%、细胞壁上占 34%、胞浆中占 12%、黏质液中占16%14。因此，考虑通过添加吐温促使胞间质中的酶释放出来。张婷等 1 4 分别研究了向基础培养基中添加吐温-20、吐温-40 和吐温-80 考察吐温种类对发酵液酶活力的影响，实验结果表明选用吐温-80 效果最好14。本实验选择吐温-80 作为表面活性剂，分别添加10、20、30、40g/L，考察其对酶活力的影响，结果见表5。吐温-80 的添加质量浓度为30g/L 时对产酶的促进效果最好，这可能是由于在添加质量浓度达到30g/L 之前，细胞膜和细胞壁的通透性随着添加质量浓度的增大而逐渐提高，在30g/L 左右菌体产酶达到最大值，而当添加质量浓度继续增大，过大的细胞膜和细胞壁的通透性影响了菌体细胞正常生命活动。因此，在后续响应面试验中选择在30g/L 左右进行研究。2.4 吐温种类对产酶的影响葡萄糖氧化酶在细胞合成过程中，分布于胞外的占2.5 Box-Behnken 响应面设计优化培养基采用Box-Behnken 响应面试验设计确定显著因素的最优水平，试验设计见表6，结果见表7，系数估计见表8、9。由Design-Expert 7.1.3 软件拟合得到多元回归模型为：Y=1.51+0.075X1+0.035X2+0.045X30.0025X1X20.017X1X30.022X2X3 0.56X12 0.046X22 0.036X3结果表明，决定系数R2=0.9638，说明回归方程的拟合较好。模型的F=20.73，该值远远大于0.0003，表明回归方程的F 检验显著，所拟合的二次回归方程合适。能解释96.38% 响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是合适的，可以用此模型进行分析和预测。由响应面回归分析和回归方程拟合绘制响应面图形(图13)。说明该模型能解释97.99% 响应值的变化，该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是适合的，可以用此模型对产葡萄糖氧化酶菌株的发酵培养基进行分析和预测。注：P 0 . 0 5 时模型差异显著。来源平方和自由度均方F P模型0.11 9 0.012 27.73 0.0003误差总计0.00395 7 0.0005533失拟误差0.00375 3 0.00125 25 0.0047纯误差0.0002 4 0.00005总计0.11 16R2=0.9638 R2Adj =0.9173表8 回归模型方差分析表Table 8 Analysis of variance (ANOVA) for the developed regressionequation试验号X1 X2 X3 Y/(U/mL)1 1 1 0 1.372 1 0 1 1.383 0 0 0 1.504 1 1 0 1.455 0 0 0 1.516 0 0 0 1.527 0 1 1 1.468 0 1 1 1.449 0 1 1 1.3010 0 1 1 1.5111 1 1 0 1.4912 1 0 1 1.5213 1 1 0 1.3214 0 0 0 1.5115 1 0 1 1.4916 0 0 0 1.5117 1 0 1 1.28表7 Box-Behnken 响应面试验设计及结果Table 7 Box-Behnken response surface design arrangement andexperimental results编码因素水平X1 葡萄糖80g/L 100g/L 120g/LX2 复合氮源30g/L 35g/L 40g/LX3 吐温-80 20g/L 30g/L 40g/L表6 响应面试验因素水平表Table 6 Factors and levels in response surface design由表8 方差分析(ANOVA)可以看出，F回归=27.73 F0.01(9，4)=14.66，P=0.0003 表明模型高度显著，不同处理间的差异极显著；模型的调整确定系数R2Adj=0.9173，说明该模型能解释91.73%响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型对实际的发酵情况进行分析和预测。从表9 回归模型系数显著性检验可知：模型的一次项x1(P 0.0001)、x2(P=0.0042)、x3(P=0.0011)、X12(P=0.0018)、X22(P=0.0052)和X32(P=0.0166)极显著，其他项不显著。多元回归模型Y=1 .51+0.07 5X1+0 .03 5X2+0.045X30.0025X1X20.017X1X30.022X2X30.056X12项估计值F P FX1 0.075 79.75 0.0001X2 0.035 17.37 0.0042X3 0.045 28.71 0.0011X1X2 0.0025 0.044 0.8393X1X3 0.017 2.17 0.1841X2X3 0.022 3.59 0.1000X12 0.56 23.61 0.0018X22 0.046 15.96 0.0052X32 0.036 9.81 0.0166表9 回归模型参数方差分析表Table 9 Significance test of each regression coefficient of the developedregression equation注：P 0 .0 5 时模型参数差异显著。0.046X22 0.036X32 可以优化为Y=1.51+0.075X1+0.035X2+0.045X3 0.056X12 0.046X22 0.036X32。图1 葡萄糖和复合氮源质量浓度对酶活力影响的响应面图Fig.1 Response surface plot showing the interactive effects of complexnitrogen source and glucose concentrations on enzyme activity1.5501.4851.4201.3551.290葡萄糖氧化酶活力/(U/mL)复合氮源质量浓度/(g/L)1.000.500.000.501.00 1.000.500.000.501.00葡萄糖质量浓度/(g/L)图2 葡萄糖和吐温-80 质量浓度对酶活力影响的响应面图Fig.2 Response surface plot showing the interactive effects of Tween-80and glucose concentrations on enzyme activity1.55001.48251.41501.34751.2800葡萄糖氧化酶活力/(U/mL)吐温-80 质量浓度/(g/L)1.000.500.000.501.00 1.000.001.00葡萄糖质量浓度/(g/L)0.500.50图3 复合氮源和吐温-80 质量浓度对酶活力影响的响应面图Fig.3 Response surface plot showi