农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得.doc

农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得摘要：将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因通过农杆菌介导的遗传转化方法，转入水稻品种中花，在含 b的选择培养基上筛选，获得棵抗性植株，对目标基因检测，获得棵阳性植株，初步证明目标基因已整合到中花基因组中。关键词：转基因水稻；硝酸盐转运蛋白；氮高效利用transgenic high n use efficiency rice obtained by agrobacterium tumefaciens ， ， ， ， （ ， ， ，）： ： transgenic ； ； 植物的生长需要合适的氮量，氮是限制植物生长的重要因素。硝酸盐（）是植物主要氮源之一，硝酸盐供应量的不足经常成为限制作物生长的因素。但过量硝酸盐如果没有被植物吸收，极易通过淋失、渗透等途径转移到水环境中，造成水体硝酸盐污染的潜在危险，对生态环境和人体健康产生极为不利的影响。氮肥施用量对晚稻产量和氮肥利用效率有影响，采用氮素运筹可影响免耕移植水稻产量及氮素利用率6，7。因此，提高氮肥的利用效率，对于促进氮肥的高效利用和减轻环境污染具有重要的意义。水稻是最早通过基因工程手段进行品种改良的作物之一，我国的转基因生物新品种培育重大专项也已实施，但提高水稻氮素利用率，培育氮高效利用的转基因水稻研究方面的研究不多8，因此迫切需要利用新的基因工程策略，培育氮高效利用的转基因水稻新种质。该研究通过农杆菌介导的遗传转化方法，将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因导入中花中，旨在培育氮肥高效利用的转基因水稻，减少氮肥施用量，节约水稻生产成本，从而降低环境污染，促进农业高效节能、可持续发展。 材料与方法 材料用于研究的水稻材料为中花，植物表达载体由中国农业科学院生物技术所刘昱辉博士惠赠，根癌农杆菌菌株为。 方法1.2.1 水稻胚性愈伤组织的获得 将成熟种子剥壳后放在或 三角瓶中进行常规消毒，接种于诱导培养基中，每皿约粒，封口膜封好后于 暗培养。2.2 农杆菌介导的遗传转化 农杆菌在培养基上 培养2 d后，用药勺刮取少量菌斑悬浮于含有 的乙酰丁香酮的培养基，调整菌液浓度至nm左右。将经过预培养的水稻成熟胚诱导的胚性愈伤组织置于农杆菌悬浮液中，略微摇动后静置 ，然后将愈伤组织置于培养皿中无菌滤纸上，在超净工作台中吹干。最后将愈伤组织转入添加有 的乙酰丁香酮的共培养基上， 暗培养 。2.3 抗性愈伤组织的筛选 待愈伤组织共培养 ，取出愈伤组织，用无菌水冲洗次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。然后用含 羧苄青霉素的无菌水再清洗一遍，置于无菌滤纸上吹干后，转移至选择培养基（添加 羧苄青霉素以及 b）筛选抗性愈伤组织。每两周将愈伤组织转移至新选择培养基上，约需次继代培养获得抗性愈伤组织。2.4 抗性植株的获得 将抗性愈伤组织转移到分化培养基上进行分化培育，每一瓶中可放置块不同克隆的愈伤组织。周后愈伤组织开始转绿，周后幼苗长到 时，可进行生根培养。2.5 转基因植株的检测 法提取水稻总。扩增基因片段的引物序列为：-，：-。扩增目标片段大小为，反应条件为： 、 ； 、 ， 、 ， 、 ，个循环； 、 ， 保存。以表达载体质粒、中花基因组分别作为阳性及阴性对照。 结果与分析 抗性植株的获得中花成熟种子在诱导培养基上培养周，即可看到盾片处有愈伤组织形成，继续在原培养基上培养个月，即可获得颜色鲜黄、质地紧实的颗粒状胚性愈伤组织（图），诱导率达。愈伤组织与农杆菌共培养 后，经脱菌进行选择培养。约继代培养次后，获得抗性愈伤组织（图），抗性愈伤组织获得率为。抗性愈伤组织经分化培养周可获得抗性植株（图），分化率为.0。抗性植株在生根培养基上生根率达到，共获得抗性植株456棵。 转基因植株的检测结果根据基因的序列设计一对特异性引物，对获得的所有抗性植株进行阳性检测。有棵检测到 目的基因片段，阳性率为，部分植株检测结果见图。 讨论）中国的水稻氮肥施用量占全球水稻施用量的，氮肥利用率远远低于全球的平均水平；中国水稻种植施用的氮肥占氮肥总使用量的9。过量施用氮肥导致环境污染，降低了农民的收入。研究将从海藻中克隆的硝酸盐转运蛋白基因，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻品种中花中，对获得的再生植株基因检测表明目标基因已整合到中花基因组中。）为了明确基因在转基因水稻中能否提高氮素利用率，对部分目标基因阳性单株进行杂交，以期检测目标基因单拷贝整合的转基因植株，目前该工作正在进行。并将进一步利用对单拷贝转基因株系中基因的表达进行分析，筛选出基因不同表达水平的转基因株系，并对不同株系的节氮效果进行试验，从而为转基因水稻的氮素利用效率做出科学评价，为进一步培育氮高效利用新品种奠定基础。参考文献： ， ， ， ，： ， ，（）： ， ， ： ，（）： ， y ，1，（）： ， ， ， ，（）：6 李向辉，鲁艳红，廖育林，等 氮肥施用量对晚稻产量和氮肥利用效率的影响湖南农业科学，（）：7 姜新有，周江明氮素运筹