天然药物活性筛选考卷.doc

2012级硕士研究生期末考题(1) 请列举5种转基因动物可用于老年痴呆药物研究，并简要说明它们的特征和应用范围（5分）i APP转基因小鼠：病理特征：APP水平是正常鼠的6倍， Ab增高10-14倍，出现淀粉样血管病变，脂质氧化损伤，超氧化物歧化酶增加 。行为学特征：9-10月龄小数空间辨识能力受损。应用范围： APP 转基因鼠可用于抗老年痴呆中药的药效评价、活性筛选以及作用机制的研究。ii APOE小鼠特征：该模型的转基因小鼠动脉壁损伤严重,内皮细胞出现受损、变质、脱落,细胞内连接不紧密。内皮下间隙增宽,内弹力膜破坏和消失；中膜平滑肌结构破坏,合成型平滑肌较多。应用范围：可用于模拟小鼠老化过程中动脉粥样硬化进程，以及药物等因素对动脉粥样硬化进程的影响。iii 神经组织特异表达CTF1转基因小鼠特征：转入的CTF1基因在脑组织的表达水平均高于同龄对照小鼠，CTF1转基因小鼠大小脑组织基本结构形态与正常小鼠对照没有异常。应用范围：用于研究CTF1生物学功能与老年痴呆等疾病发病机制的关系。iv 快速老化SAM-P小鼠特征： 老化迅速，且其海马甲醛含量随老龄化进程而增加。应用范围：研究内源性甲醛异常蓄积与记忆衰退关系，研究大鼠老化机制等。PS1-GFP小鼠特征：高表达早老蛋白PS1应用范围：研究早老蛋白的结构和功能，了解其导致老年化的机制。(2) 请比较细胞活性检测的几种方法的异同，包括MTT法、Hoechst 染色法、细胞排染实验、细胞克隆形成实验，包括实验目的、原理、方法、优缺点等（10分）MTT法实验目的：在肿瘤增值实验中，根据活细胞功能强弱，推测出活细胞相对数目或相对活力。原理：活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的MTT，生成蓝紫色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。方法：细胞培养，传代，计数后接种，加药处理72小时后，加入MTT溶液(5mg/ml)，孵育2-4小时，弃去培养液，加入DMSO溶解生成的甲臜，用酶标仪测试OD值。优点：操作简单。缺点：只能测得活细胞相对数目或相对活力，不能测定细胞绝对数。 Hoechst 染色法实验目的：通过活细胞及死亡细胞hoechst染色后颜色分布不同，对活细胞和死亡细胞分别计数，计算细胞存活率。实验原理：Hoeschst333258与DNA特异性结合发出蓝色荧光。活细胞成均匀的淡荧光，调亡细胞核或细胞质内则为强荧光的颗粒状物质。实验方法：肿瘤细胞用Hoeschst333258染色后，在荧光显微镜下观察，记录死亡和活细胞数目。优点：不用加入染色剂，hoeschst与DNA结合后，在紫外激发下可自发光。缺点：计数过程复杂且耗时耗力。细胞排染实验实验目的：根据死亡和活细胞染色颜色不同，计数死亡和正常细胞的数目，计算细胞存活率。原理：细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正常细胞排染，而死亡细胞染成蓝色。方法：细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀，用细胞计数板，分别计数活细胞（未染色）和死细胞（蓝色）数目。优点：测得活细胞的准确数目，缺点：数目多且一般要同一个人完成，计数过程复杂且耗时耗力。细胞克隆形成实验实验目的：根据细胞是否具有克隆能力，进行活细胞计数实验原理：具有克隆能力的细胞为活细胞，通过计数克隆团的数目，测定活细胞数目。试验方法：将药物处理后的细胞培养至克隆团出现时，终止培养，加药固定细胞，显微镜计数克隆团数目。优缺点：克隆测定则确切地反映了具有克隆能力的活存细胞数，并且适用于所有生长形式的细胞。缺点：操作繁琐，且培养时间较长。(3) 请举例说明蛋白组学在心血管系统药物研究中的应用，标注参考文献。（5分）应用二向电泳、图像分析、质谱鉴定等蛋白质组学技术测定药物作用于心血管细胞后引起表达量有显著变化的蛋白质，找到药物的作用蛋白，进一步探讨药物发挥作用的分子机制，为寻找心血管疾病的潜在靶标奠定基础。吕俊萍,王树人,马增春等.运用蛋白质组学技术研究TNF-对血管内皮细胞的作用机制J.中国病理生理杂志.2004(07)(4) 请说明时间分辨荧光（TRF） 和均相时间分辨荧光（HTRF）的技术原理和各自的优势。（5分）时间分辨荧光：以镧系元素(稀土离子：铕、钐、镝、铽）为复合物的荧光试剂，发射光衰减时间长，可以关闭激发光后再检测。因此杜绝了激发光的干扰，信号灵敏度和准确度比普通荧光试剂更高。优点：快速（短时间特异性结合） 高通量；高灵敏（nmol或pmol水平)；功能性筛选（激动或拮抗）；药效团分析（分子筛选）广泛应用于高通量筛选模型。均相时间分辨荧光HTRF 技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer） 和时间分辨荧光（TRFTime Resolved Fluorescence)）两种技术。利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和XL665作为一个供体（Donor），是基于Eu穴状化合物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的荧光共振能量转移（FRET）。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。优点：结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer） 和时间分辨荧光（TRFTime Resolved Fluorescence)）两种技术，且比一般的TR-FRET具有更高的灵敏度和稳定性。(5) 试列举出十种常用的荧光探针，指出它们的应用范围和检测波长（5分）i芘 (Kex=335 nm,Kem=372,385 nm)，常用来测定极性溶液中蛋白质定量以及蛋白极性。ii 4-氨甲基-7-烷氧基香豆素衍生物Photocaging荧光探针分子(Kex=390 nm,Kem=480 nm)用于快速、高通量检测细胞色素P450 2D6的分析。iii罗丹明B荧光探针，最大吸收/发射在496/520 nm,极为适合于标记寡核甘酸,因为蛋白质会引起大多数罗丹明类荧光猝灭,故大多数不适宜用于标记蛋白。但近年以罗丹明类作为底物研究蛋白质、酶类引起了广泛关注。iv溴化乙锭荧光探针，最大激发波长是232nm和最大发射波长615nm;用于色氮酸二肽(Trp.Trp)与小牛胸腺DNA的作用机制进行了研究。v 8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)疏水探针。最大吸收/发射在375/500 nm,在一定范围内,荧光强度与蛋白质的浓度呈线性关系，可用于蛋白质浓度测定。vi中性红(NR)分子探针，激发波长为467nm，发射波长为500800nm范围内的荧光光谱，研究通过测定药物与DNA结合的规律，研究药物对DNA的作用机制。 2,7-二氯荧光素乙酰乙酸盐(2,7-di-chlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)荧光探针法，激发波长 488 nm，发射波长 525 nm，用于检测细胞活性氧类(reactive oxygen species, ROS)水平。vii荧光素衍生化试剂2,7-二(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素(BCECF)探针，最大吸收/发射在492/525 nm，可用于研究细胞表面多药耐药基因MDR的表达产物：P-蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白MRP及乳腺癌耐药蛋白BCRP的耐药机制,对新型抗癌药物的开发研制具有一定的理论指导作用。viii 1, 3-二苯基异苯并呋喃(1, 3-Diphenylisobenzofuran, DPBF)荧光探针，Kex/Kem=403 nm/447 nm，用于生物体内生化反应机理的研究。ix MTHBM-Ni荧光探针，激发波长和发射波长为Kex/Kem=294. 5/498. 0 nm 用于对制剂中化合物的定量。x 2,7-二氯荧光素乙酰乙酸盐(2,7-di-chlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)荧光探针法，激发波长 488 nm，发射波长 525 nm，用于检测细胞活性氧类(reactive oxygen species, ROS)水平。(6) 从中药中分离得到的一个新化合物，想知道其是否具有抗肿瘤活性？请设计一个抗肿瘤药物的筛选方案。（10分）样品初筛：1) 样品的制备 样品干燥，精密称定25mg，用PBS、水或有机溶剂溶解，一般浓度需不大于50 mM，超声后除菌，-4或-20度冷冻保存。2) 以倍半稀释法稀释样品溶液至四个浓度，并平行34复孔。同时设置阳性对照品。3) 实验：选择相应肿瘤的细胞株，培养传代，计数后接种于96孔板上，贴壁24小时，或对数生长期。加药处理72小时或指定时间。加入MTT(5mg/ml)孵育24小时，弃去培养液，加入DMSO溶解生成的甲臜，用酶标仪测定甲臜含量，评价活细胞的相对数目。4) 计算数据的标准偏差，重复初筛23次。5) 若有效浓度20 M，则可以进行样品复筛。样品复筛根据初筛的有效浓度，设置68个不同的浓度点，进行如上独立细胞实验35次，已获得量效曲线，计算IC50 or EC50。(7) 试举一例说明双报告基因真核表达质粒的构建和表达，标注参考文献(10分) 高明珠等人，以pEGFP-N1和pDsRRed-N1为模板，PCR扩增EGFP和DsRed基因，插入表达载体pCI中，分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed，利用载体上Bgl II和BamH I为同尾酶的特点，将两个表达质粒酶切后拼接，构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed -cmvEGFP，经酶切鉴定和测序证实构建正确，两启动子为顺向相连。转染293T细胞，荧光显微镜观察到EGFP和DsRed可同时正确表达。高明珠,朱瑞宇,陈蕴等.双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达J.中国生物制品学杂质,2012 (9)。(8) 根据文献1，说明p-IKKa(Ser176/Ser180)活化剂筛选的原理和方法（10分）原理：AlphaScreen SureFire technology 为一种测定细胞裂解液中磷酸化蛋白的具有高灵敏、定量及操作简便的测定方法。检测中，AlphaScreen 的供体和受体部位捕获三明治抗体复合物，仅在细胞裂解液中形成，以使他们相互靠近。供体部位的激发可释放出单线性分子，导致受体部位级联能量转移，释放出大约在520-620nm波长的光。 很多激活NF-B的因素都是通过I-B 的磷酸化和随后蛋白酶体介导的降解这一常规途径完成的。其中的关键一步包括I-B kinase (IKK)复合体的激活。I-B kinase (IKK)复合体为三个亚基的复合体，IKK 和 IKK是复合体的催化部位，而IKK发挥调控作用。在IKK 和 IKK的活化环中Ser176和 Ser180的磷酸化，导致了构想变化和酶的激活。试剂盒包含识别磷酸化Ser176/180抗原的抗体复合物，以及一个远端抗原，可与具保守的螺旋 - 环 - 螺旋结构的无处不在的激酶（IKK）结合。试剂盒检测的蛋白可对应于GenBank Accession NP_001269。IKK又可写作 IKK1, IKKA, IKBKA, TCF16, NFKBIKA, IKK-alpha 以及 CHUK.方法：AlphaScreen SureFire细胞测试可以根据监测的需要进行多种不同的设置。一般设置为，将细胞裂解液培养于细颈瓶以及组织培养板中，而后转移到检测板中分析。高通量的设置中，多个细胞可以在单个板中进行激活、裂解和分析。一般的二板设置：在组织培养板中准备细胞，根据需要加入激动剂和拮抗剂；使用1X裂解缓冲液制备细胞裂解液；将部分裂解液转移到分析板中；加入受体与裂解液混合，孵育；加入受体与裂解液混合，孵育；读板。高通量设置：在分析板中准备细胞，根据需要加入激动剂和拮抗剂；使用5X裂解缓冲液制备细胞裂解液；加入受体与裂解液混合，孵育； 加入受体与裂解液混合，孵育；读板。(9) 目前常用的天然产物活性成分溶剂提取方法有哪些？各有何优缺点？(10分)目前常用的天然产物活性成分溶剂提取方法主要有：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法以及连续回流提取法。1) 浸渍法：优点：操作简便，提取物中所含杂质较少。缺点：操作时间较长，耗用溶剂较多，提取效不高。浸出液体积大，浸出液与药渣的分离比较麻烦。2) 渗漉法优点：浸提效率较浸渍法高；且溶剂耗量少，与药渣分离较易；且提取中杂质含量较少。缺点：对药材的粗细及工艺技术条件要求较高，掌握不好可影响浸出效果。3) 煎煮法优点：操作简单，提取效率高，成本低。缺点：杂质多，煎出液易霉败变质；高温操作易造成热不稳定的活性成分变化。4) 回流提取法优点：操作简单，节省溶剂，提取效率高。缺点：提取物中杂质含量较高，不利于进一步的精制；高温操作易造成热不稳定的活性成分变化。5) 连续回流提取法优点：节省溶剂，提取效率高。缺点：仅适用于少量药材的提取，且高温操作易造成热不稳定的活性成分变化。(10) 聚酰胺色谱、凝胶色谱、大孔吸附树脂色谱及离子交换色谱的基本分离原理分别是什么？分别适合何种化合物的分离与纯化？(10分)聚酰胺色谱分离原理：氢键吸附原理，基于酰胺键。用于分离酚类、酸类、醌类、硝基化合物。极性吸附原理，基于非极性脂肪链。适于萜类、甾类、生物碱和黄酮苷类的分离与纯化。凝胶色谱分离原理：分子筛：分子的大小和形状；吸附色谱：被分离化合物与凝胶的氢键；分配色谱：被分离化合物在流动相和固定相之间的分配。适于苷类、生物碱类、黄酮、蒽醌、内酯、萜类、甾类和多酚的分离纯化。大孔吸附树脂色谱分离原理：非极性吸附树脂在吸附药液中成分时，主要是依靠物理结构（如比表面积、孔径等）起作用，不同的树脂有不同的针对性。适合中等级性的水溶性化合物：天然色素，从发酵液中得到抗生素（青霉素、先锋霉素、螺旋霉素）、蛋白质（胰岛素、肽系抗生素）、功能性食品添加剂（维生素）等。聚苯乙烯合成吸附树脂吸附含有电子的化合物，如含有苯环和共轭双键的化合物；甲基