MTT的测定方法基本上是利用细胞本身的酵素对受质的作用.doc

MTT的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，進行本實驗時應特別注意。细胞增殖的测定：四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)3：选择对数生长期细胞，用0.25胰酶消化58min，调整细胞浓度为5104/mL加于96孔培养板，每孔100L，再分别加入不同浓度药物（1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2mg/mL），并设置培养液对照。置37，体积分数为5CO2条件下培养5672h，于结束前4h加入MTT10L/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100L/孔，振荡10min左右，置酶标仪测A值，波长为570nm。用含15小牛血清的1640培养液将801-D细胞或肿瘤细胞接种于96孔板，每孔100?l，设空白组及不同肿瘤细胞浓度组，每组分别设为5102、1103、5103、1104、2104、5104孔。置37、5CO2饱和湿度培养72小时，弃上清。每孔加MTT 20?l(浓度5?mgml)，继续培养4小时。加100?l DMSO，平板振荡器上震荡5分钟，在酶标仪上以570?nm波长检测。脾T淋巴细胞增殖反应测定4脾细胞（2.5105/孔）在37，5% CO2培养条件下，用10ug/ml gD蛋白（阴性对照组为RPMI1640培养基；阳性对照组为5ug/ml PHA）刺激3天。加入10ul MTT(5mg/ml)，37继续培养4小时后，每孔加入100ul DMSO溶解formazon。检测各孔490nm光吸收值（每一组设3个重复孔）；计算刺激指数（SI）=A490nm(实验组)/A490nm(阴性对照组)。3.1.1 MTT法3.1.1.1 原理当T淋巴细胞受ConA、PHA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲(formaZan)结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。3.1.1.2 丁器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2基乙醇(2ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐、异丙醇、MTT、Hanks液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)200目筛网、24孔培养板，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、联免疫检测丁、超净工作台3.1.1.3 实验步骤完全培养液 RPMI1640 培养液过滤除菌，用前加入10小牛血清，1谷氨胺(200mmol/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100ug/L)及5105mol/L的2基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.07.2，即完全培养液。ConA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(20)保存。无菌Hanks液 用前以3.5的无菌NaHCO3调pH7.27.4。MTT液 将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入4mL 1mo1/L的HC1，临用前配制。3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min (1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95以上)，调整细胞浓度为2106个/mL。3.1.1.3.3淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加50ul ConA液(相当5ug/mL)，另一孔作为对照，置5CO2，37培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50u1/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装36孔作为平行样，用联免疫检测丁，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入1mL比色杯中，在721分光光度计上比色测定，波长570nm。3.1.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析进行数据统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值，即可判定该项试验结果阳性。小鼠18只,随机分为三组,连续给药7天,于末次给药次日脱颈处死小鼠,无菌取了脾脏,在HANKS液中,用100目钢网和注射器芯研磨,经尼龙布过滤使之成为单个脾细胞悬液,计数后,用含灭活小牛血清的1640培养液配成2.510ml,加入96孔平底培养板中,每孔加20lConA或LPS，ConA 终浓度为5g/ml，LPS终浓度为10g/ml，每组三个复孔，并设相应对照孔，37C，5%CO2 100%湿度下培养72小时后，每孔加入5mg/ml的MTT10l ,37C 孵育4小时,取出后,离心去上清,每孔加入200l 酸化异丙醇,静置15分钟,待细胞代谢MTT形成的MTT甲充分溶解,用酶标仪测0D值,测定波长570nm. 1.3检测指标及方法1.3.1淋巴细胞增殖反应3：无菌制备小鼠脾细胞悬液，用RPMI-1640不完全营养液洗涤2次，1000 r/min离心10 min，然后用完全营养液配成5106/ml，取100 l加入96孔细胞培养板内(每孔含5105/ml个细胞)，加入终浓度为5 g/ml的ConA, 37，5% CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入10 l MTT溶液(5 mg/ml)，再继续培养至12 h，然后加入DMSO 100 l，充分振荡后静止20 min，用检测波长560 nm全自动酶标仪进行比色分析。1.3.2IL-2的诱生：取上述已制备的脾细胞悬液5106/ml，放培养瓶中37，5% CO2培养箱中培养40 h，离心收集上清液，-20冰箱保存备用。1.3.3制备活化的脾淋巴细胞5：按上法取正常Balb/C小鼠无菌取脾脏，制成5106/ml细胞悬液，加入ConA使其终浓度为5 g/ml，置37，5% CO2培养箱中培养48 h，收集细胞，离心洗2次，用完全RPMI-1640配成5105/ml细胞悬液，作为测IL-2的反应细胞。1.3.4IL-2活性检测：取-20保存的IL-2上清，并做1/2和1/4的稀释，在96孔平底培养板中，每孔加入IL-2上清原液或不同稀释度的IL-2上清100 l，以及上述反应细胞100 l；阴性对照不加IL-2上清，加100 l 1640培养液，各没4复孔。于37，5% CO2培养箱培养48 h，每孔加MTT(5 mg/ml)10 l，继续培养4 h，吸弃100 l上清，加入酸化异丙醇100 l(0.04 mol/L、HCl-异丙醇)，充分振荡后静止20 min，用检测波长560 nm HCl全自动酶标仪进行比色分析。1.4结果处理：实验结果采用组间均数差异性t检验的方法进行统计分析。第四节 细胞计数及活力测定 一、原理 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 二、仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计） 2、试剂：0.4台盼兰，0.5四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇 3、材料：细胞悬液 三、操作步骤 （一）细胞计数 1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml4大格细胞总数/ 410000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 （二）细胞活力 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 （三）MTT法测细胞相对数和相对活力 活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 2、沉淀加入0.51ml MTT，吹打成悬液。 3、37下保温2小时。 4、加入45 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 第五节 细胞的分裂指数 一、原理:体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 二、仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：CO2培养箱、普通显微镜、细胞培养血、盖玻片、吸管 2、试剂：培养液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液 三、操作步骤 1、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 2、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。 3、取出盖片，按下列顺序操作： PBS漂洗3分钟甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟Giemsa液染色10分钟自来水冲洗。 4、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 5、计算: 分裂指数=分裂细胞数/总细胞数100% 四、注意事项;操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。 第六节 细胞周期的测定 一、原理:细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。 二、仪器、用品与试剂 1、仪器、用品：同常规细胞培养 2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2SSC液 三、操作步骤 1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10g/ml。 2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1g。 3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。 4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。 5、染色体玻片置56水浴锅盖上，铺上2SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。 6、弃去2SSC液，流水冲洗。 7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。 8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。 9、计算： 细胞周期（Tc）=48/（M1+2M2+3M3+4M4）/100（小时） 第七节 培养物的污染及防止 按现代的观念，凡是混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。根据这一概念，组织培养污染物应包括生物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分）、细胞（非同种的其他细胞）。其中一微生物最为多见。另外，随着使用细胞种类增多，不同细胞交叉污染，尤其是Hela细胞的污染也时有发生，从而造成细胞不纯。 一、污染途径 污染物，特别是微生物常通过下列途径进入培养体系，造成污染 1 空气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面，造成污染。 2 器材：各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染 3 操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。培养两种细胞以上时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液、瓶等有可能导致细胞交叉污染。 4 血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。 5 组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。 二、污染对培养细胞的影响及污染的检测 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复、但是当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分类象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强细胞浆出现颗粒、污染较严重，细胞增值停止，分裂象消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。 （一）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测 常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。 如果培养无真的细菌污染，24小时内可以获得阳性结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。 （二）真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 微生物污染中以真菌最多，真菌种类繁多，形态各异，但是污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。 （三）支原体污染对细胞影响及污染物的检测 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题,是细胞培养最常见的、干扰试验结果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在被应用。研究表明，95以上是以下四种：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到支原体污染。 污染来源包括工作环境污染、操作者本身污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。 细胞培养中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染： 控制环境污染； 严格实验操作； 细胞培养基和器材要保证无菌； 在细胞培养基中加入适量的抗生素。 支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。 （四）细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测 细胞培养中，细胞间交叉污染并不罕见，多是由于在培养中操作时各种细胞同时进行，混杂使用器皿和液体所致，这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻、不易察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。常用观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。 三、污染的预防:防止污染，预防是关键，预防措施应该贯穿整个细胞培养的始终。 1.器皿准备中的预防：用于细胞培养的器皿应该严格消毒，做到真正洁净；应该无菌的物品，要做到消毒严格、真正无菌；器皿的运输、贮存过程中，要严格操作，谨防污染。 2.开始操作前的预防：应当按厂家规定，定期清洗或更换超净台的空气滤网，请专职人员定期检查超净台的空气净化标准；检查培养皿是否有消毒标志，有条件得实验室可以使用一次性用品；检查新配置的培养液，确认无菌方可使用；操作前提前半小时启动超净台的紫外灯消毒；操作应戴口罩，消毒双手。 3.操作过程中的预防；主要包括：超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口和瓶塞内侧；在安装吸管冒、开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯烧灼，并在火焰附件工作；吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用，防止污染扩大或造成培养物的交叉污染；使用培养液前，不易较早开启瓶口；开瓶后的培养瓶应保持斜位，避免直立；不再使用的培养液应立即封口；培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中；操作时不要交谈、咳嗽，以防唾沫和呼出气流引发污染；操作完毕后应将工作台面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净台。 4.其他预防：及早冻存培养物；重要的细胞株传代工作应有两个人独立进行；购入的未灭活血清应采取56度水浴灭活30分钟使血清的补体和支原体灭活；为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统的抗生素，或尽可能不用抗生素；对新购入的细胞株应加强观察，防止外来的污染源；定期消毒培养箱。 四、污染的排除:培养的细胞一旦污染应及时处理，防止污染其他细胞。通常选高压灭菌被污染的细胞，然后弃掉。如果有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常。常用的排除微生物污染的方法有以下几种： 1 抗生素排除法：抗生素是细胞培养中杀灭细菌的主要手段。各种抗生素性质不同，对微生物作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后应用好；如果发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。有的抗生素对细菌仅有抑制作用，无杀灭效应。反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，而且对细胞本身也有一定影响，因此有人主张尽量不用抗生素处理，当然，一些有价值的细胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在这种情况下，可采用510倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用2448小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。 2 加温除菌：根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支原体污染的细胞置于41度中作用510小时（最长可以达18小时）杀灭支原体。但是41度对细胞本身应有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。 3 动物体内接种：受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，从体内取出再进行培养繁殖。 4 与巨噬细胞共培养：在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活710天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的科隆生长。与体内情况相似，巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。利用96孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度地同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染地效能。本方法与抗生素联合应用效果更佳细胞培养常见问题及其解决 1. 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。 2. 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。 7.Hanks 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液(HBS)和Earles平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 8. 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 9. 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。 10.冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于20 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。 13.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。 14. 细胞冷冻培养基之成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。 15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？ 冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。 16.冷冻保存细胞之方法？ 冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 C 3060 分钟 (-20 C30 分钟*) -80 C 1618 小时(或隔夜) 液氮槽vaporphase 长期储存。 冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 C 至80 C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。 17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。 18.培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。 19.应如何避免细胞污染？ 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 20.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 原则上：直接灭菌后丢弃之。 当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。 2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。 4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。 5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 6.重复步骤4。 7.在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。 21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？ 不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。 22.支原体污染会对细胞培养有何影响？ 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 23. 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？ 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？ 定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。 25.为何培养基保存于4 C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？ 培养基保存于4 C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。 26. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？ 不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。 27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？ 研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。 28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于80 C 太久。 29. 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？ 冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。30.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 31.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 32.什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 33.如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。 34.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 35.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 36.室温下配制的Tris-HCl溶液，在37使用时PH值是多少？ 缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4，25，37时，不同PH值。 50mM Tris-HC 溶液在4，25，37时，不同PH值 4C 25C 37C 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 37.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？ 我们推荐使用脱落细胞的方法，此技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。 38.胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞： 1. 去除培养基。 2. 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS。 3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。 4. 37 孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。 5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。） 6. 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。 7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 39.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？ 为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。 40.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？ 通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过95的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。 41.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫? 这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。 42. 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？ 如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。 43. 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗？ 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 44. 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？ 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？ 大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。 46.为什么要在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液? 胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。 47.保存血清最好的方法? 我们建议血清应保存在-5至-2O。若存放于4时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。 48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损? 将血清从冷冻箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。 49. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理? 血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。 若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。 50. 为什么要热灭活血清? 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 51. 有必要做热灭活吗? 实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。 若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量! 52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀? 有些胎牛血清产品没有预老化，储存在28时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在20储存胎牛血清，避免反复冻融。 53. 如何避免沉淀物的产生? 我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作: (1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37)，非常容易产生沉淀物。 (2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。 (3)请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 (4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做