选修三12基因工程的基本操作程序课件

1 2基因工程的基本操作程序 2020 2 27 1 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 编码区 能转录 编码蛋白质 非编码区 不编码蛋白质 能调控遗传信息表达 2020 2 27 2 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子 外显子 与RNA聚合酶结合位点 编码区 非编码区 外显子 内含子 能编码蛋白质的序列 不能编码蛋白质的序列 2020 2 27 3 非编码区 非编码区 编码区 RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 终止子 启动子 原核 真核 基因的结构 2020 2 27 4 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 连续 不连续 编码区 非编码 2020 2 27 5 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 2020 2 27 6 目的基因主要是指 编码蛋白质的基因 目的基因的获取 即 将需要的基因从供体生物细胞内提取出来 目前被广泛提取使用的目的基因有 苏云金杆菌抗虫基因 植物抗病基因 抗病毒 抗细菌 人胰岛素基因等 也可以是一些具有调控作用的因子 2020 2 27 7 一 获得目的基因的方法 1 从基因文库中获取目的基因 1 什么是基因文库 2 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因 基因的核苷酸序列等 2 利用PCR技术扩增目的基因3 人工合成 含有一种生物的全部基因 含有一种生物的部分基因 根据基因的有关信息 如基因的转录产物mRNA 未知序列 基因较小已知序列 已知序列 2020 2 27 8 1 用一定的 切割质粒 使其出现一个切口 露出 2 用 切断目的基因 使其产生 核心 3 将切下的目的基因片段插入质粒的 处 再加入适量 形成了一个重组DNA分子 重组质粒 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 2020 2 27 9 二 基因表达载体的构建 质粒 DNA分子 限制酶处理 一个切口两个黏性末端 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 核心 二 基因表达载体的构建 4 过程 2020 2 27 10 科学家在培育抗虫棉时 经过了许多复杂的过程和不懈的努力 才获得成功 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中 然后导入棉花的受精卵中 结果抗虫基因在棉花体内没有表达 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子 抗虫基因首端 导入棉花受精卵 长成的棉花植株还是没有抗虫能力 科学家又在有启动子 抗虫基因的质粒中插入终止子 抗虫基因末端 导入棉花受精卵 结果成长的植株 有了抗虫能力 资料 2020 2 27 11 基因表达载体的组成 目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 同时使目的基因能够表达和发挥作用 2020 2 27 12 常用的受体细胞 动植物细胞 大肠杆菌 土壤农杆菌 枯草杆菌等 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 转化 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 受体细胞 稳定 表达 2020 2 27 13 三 将目的基因导入受体细胞 方法 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞吸收DNA分子 三 将目的基因导入受体细胞 2020 2 27 14 Hind限制性酶 目的DNA Ti质粒 苏云金杆菌 构建表达载体 Bt毒素蛋白基因 DNA连接酶 T DNA 可转移 DNA 知识拓展 农杆菌转化法的过程 培养 培养 导入 含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌 含有氨苄青霉素的完全培养基 不能存活 Ca2 处理细胞形成感受态细胞 检测 培养不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性积基因的农杆菌 具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌 不具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌 完全培养基 含有氨苄青霉素的完全培养基 证明 目的基因已导入 存活 脱分化 组织培养 脱分化 导入植物细胞通过组织培养产生新个体 再分化 移植 个体生物学水平的鉴定 如虫吃后中毒死亡 则说明摄入了抗虫基因并得到表达 导入植物细胞 组织培养 花粉管通道法 将目的基因导入植物细胞 操作方法 特点 在植物花受粉后 花粉形成花粉管还末愈合前期 剪去柱头 然后 滴入DNA 含的基因 使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 十分简便经济 例 转基因抗虫棉 基因枪法 利用压缩气体产生的动力 将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中 使目的基因与其整合并表达的方法 操作方法 金属粒 将目的基因导入单子叶植物细胞 钨粉粒子和金粉粒子 粒子的直径一般在0 6 4um 适用 单子叶植物 细胞类型 操作程序 显微注射法 3 将目的基因导入动物细胞 发育成新性状动物 移植到子宫或输卵管 培养成早期胚胎 显微注射 取受精卵 提纯含目的基因表达载体 受精卵 将目的基因导入受体的方法 2020 2 27 21 四 目的基因的检测与鉴定 检查是否成功 检测 鉴定 检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 方法 方法 DNA分子杂交 分子杂交 抗原 抗体杂交 2020 2 27 22 1 检测 转基因生物的DNA 探针 15N 15N 14N 14N 1 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 基因探针 放射性同位素等标记的DNA分子 方法 DNA分子杂交技术 变性 变性 变性 方法 分子杂交技术 2 检测目的基因是否转录出了mRNA 探针 15N 15N 转基因生物的mRNA 14N 14N 提取 3 检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法 抗原 抗体杂交 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注射小鼠体内 从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带 脱分化 组织培养 证明 提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样 例 用棉铃饲喂棉铃虫 如虫吃后不出现中毒症状 说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达 如虫吃后中毒死亡 则说明摄入了抗虫基因并得到表达 2 鉴定 个体生物学水平的鉴定 1 多细胞个体 抗虫 抗病结种实验 活性比较实验 不能 受体细胞必须表现出特定的性状 才能说明目的基因完成了表达 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗 若不能表达 要对抗虫基因再进行修饰 细菌的检测 将每个受体细胞单独培养形成菌落 检测菌落中是否有目的基因的表达产物 淘汰无表达产物的菌落 保留有表达产物的进一步培养 研究 2 单细胞生物 目的基因的检测与鉴定 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 2020 2 27 29 直接分离法 用限制酶切成许多片断 2 构建基因文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断 导入受体菌的群体中储存 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 称为基因文库 2020 2 27 30 直接分离法 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 重组DNA 限制酶 分别与载体连接 受体细胞 分别导入 2 构建基因文库 2020 2 27 31 cDNA合成过程 2020 2 27 32 基因文库的构建方法 2020 2 27 33 依据 目的基因的有关信息 如 根据 基因的核苷酸序列基因的功能 基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因的表达产物蛋白质等特性 3 如何从基因文库中得到所需要的基因 2020 2 27 34 利用PCR技术扩增目的基因 原理 DNA双链复制前提 要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列 以便合成引物 2020 2 27 35 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 条件 前提条件 原理 方式 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 结果 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA双链复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 利用PCR技术扩增目的基因 2020 2 27 36 过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 退火 复性55 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 从引物的5 端 3 端延伸 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 2020 2 27 37 2020 2 27 38 利用PCR技术扩增目的基因 2020 2 27 39 山西省孝义市第二中学 PCR技术扩增过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 复性 55 60 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 从引物的5 端 3 端延伸 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 2020 2 27 40