发酵设计范例（纤维素酶发酵设计）.doc

版权归乔大侠所有 乔大侠发酵设计范例摘要纤维素酶发酵是一种典型的具有代表性的生化反应过程 ，它是运用青霉或木霉菌中的一种即产纤维素酶来发酵纤维素酶。本设计全面考虑了产纤维素酶菌种的选育、培养基的配制、发酵罐的设计、发酵控制过程及机理特点，过程参数的变化，以采用秸秆，麸皮等作为主要原料，建立了纤维素酶发酵过程的模型。纤维素酶是一种应用极广泛的酶制剂，在食品，纺织，酿酒等各个行业均有应用，它可以将纤维素物质水解成简单糖，进而发酵产生乙醇，从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题，本设计研究了利用木霉，改变了对传统固体发酵进行了改进，通过液体发酵来生产纤维素酶的发酵工艺。通过各种试验证明：用青霉或木霉及液体发酵工艺来生产纤维素酶，发酵水平很高，原料来源广泛，可用于大规模生产，能产生比较好经济和社会效益。关键字 ：纤维素酶 产纤维素酶 发酵 秸秆 木霉 发酵罐 发酵控制 前言纤维素是地球上最廉价、最丰富的可再生资源。全世界每年的植物体生成量高达1500亿吨干物质，其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨。但由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造，其外围又被木质素包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难，所以到目前为止仍未能得到很好地利用。随着世界人口的骤增，资源面临短缺的危机。如何有效的利用纤维资源对解决环境污染、食品短缺及能源危机等具有重大现实意义。利用微生物产生的纤维素酶(cellulase)来分解和转化纤维素则是纤维素利用的有效途径，故对纤维素酶的研究越来越引起人们的重视。纤维素酶于1904年在蜗牛消化液中最先被人们所发现，1945年在微生物中发现了此酶，此后，纤维素酶的研究和应用便逐步受到世界各国的关注。纤维素酶作为饲料添加剂始于20世纪70年代，我国也从这一时期开始进行初步的纤维素酶研究工作，近二十年来，进行了开发性研究工作，并应用到饲料工业中，取得了一定的效果。纤维素酶是糖苷水解酶的一种，它可以将纤维素物质水解成简单糖，进而发酵产生乙醇，从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。初期的研究主要集中在对微生物纤维素酶的研究，随着对纤维素酶研究的不断深入，“动物自身不含纤维素酶”这一传统理论被推翻，动物纤维素酶成为纤维素酶研究的热点。在纤维素酶发酵生产中，主要采用秸秆，麸皮等作为有机氮源，它们在生活中都容易获得。但发酵时只运用秸秆是不行的，在发酵的时候还应加入其他的有机氮源，作为另一种有机氮源。所以我们可以秸秆、麸皮、玉米芯混合为有机氮源进行了菌种的纤维素酶发酵，同时也应加入硝酸铵等无机盐。 由于生物技术发展的很快，生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展，获得适合工业化的高比活力的纤维素酶已指日可待。我们希望在不远的将来会有更好的发酵菌落和生产方法的出现。发酵工艺总流程图菌 种种子制备种子罐发酵罐预处理过滤初步纯化酶的精制干燥成品包装原料培养基配制灭菌空气空压机过滤除菌废料处理1 生产菌种的来源11 纤维素酶产生菌的筛选 我们设计的是产纤维素酶发酵纤维素酶的整体过程，选择性分离菌株的步骤 一般是：标本采集 标本材料的预处理 富集培养 菌种初选 菌种复选 性能鉴定 菌种保藏。111 样本采集分离纤维素菌的研究主要在富含纤维素的生态环境中进行,如从朽木、土壤、粪培土、草底土、发霉秸秆和霉变玉米等样品中进行。微生物在土壤中的含量最为丰富，菌种最多，含有目的类型的微生物可能性最大。所以我们从土壤中选育我们的菌种。标本采集从森林和常年堆放木材的地方收集土样和朽木等材料。112 样本材料预处理材料预处理的方法有：化学法，物理法和诱饵法，由于产纤维素酶属于真菌的一种，比较能够耐热，同时所要求的水活度也比较低，所以将采集到的样品分别放入三角瓶中，加入适量的生理盐水，室内浸泡一定时间（每隔一段时间振荡一次），作为待检样品。113菌种的初筛 菌种的分离效率取决于分离培养基的养分，PH值和加入的选择性抑制剂在选择产纤维素酶菌时，可加入一些纤维素酶来抑制其他菌种的繁殖和生存。总的方法有：抑菌圈法，稀释法，扩散法，生物自显影法，进一步分离可以用复印平板法或铺菌法，将发酵较好的微生物选取出来。多进行几次以使菌种的达到纯净。因为生产纤维素的菌种多为真菌，所以初筛培养基为马铃薯琼脂培养基：马铃薯200g, 葡萄糖20g, 琼脂20g, 水1000mL, 自然pH值，经此过程可得真菌。114 菌种的培养将所需的菌种分离出来后，要进行对菌落的培养了，培养时最注重培养基了，如果培养基合适，那么微生物将会很快的繁殖，要注意各成分的合理搭配，对于产纤维素酶可以用马铃薯做的培养基来生长培养基配制的方法是：把马铃薯削去皮，切成小碎块，称出200克放在1000毫升水里，再煮半小时（煮开后用小火）。然后，用纱布把汤滤出来，再加进一些冷开水，使汤还变成1000毫升。最后在这1000毫升的马铃薯汤里加入20克白糖，这就做成了简易的产纤维素酶液体培养基。培养基做完后在培养之前进行灭菌，可以采用高温灭菌121 ，30 分钟高压灭菌，即可达到灭菌的效果等冷却后，将菌种接进瓶子里的马铃薯培养基里，瓶口包好，包好以后把瓶子放到25-30摄氏度的地方培养三五天。这时候你就可以看到液体里面会长出许多产纤维素酶菌了。其中产纤维素酶常用的是丝状菌，菌落多为绿色。检验各个菌落周围的斑点的大小来验证菌落的产纤维素酶能力，可以重复几次以选取较好的较纯的菌种木霉。115菌株鉴定和处理将待鉴定的菌落用牙签转移到一定pH值的筛选平板B上，37恒温培养24天；往培养皿中加入适量1mg/ml的刚果红溶液，染色；弃去染液，加入适量的1mol/L的 NaCl溶液，洗涤1小时。若细菌产生纤维素酶（CMC酶），则在菌落的周围会出现清晰的透明圈，依据透明圈的直径大小选择产酶菌株。得到菌株后对其进行诱变处理以得到高产菌株：（1）亚硝酸处理取出发菌株孢子液2. 0ml 于小瓶中,加入0. 1M NaNO2 溶液1. 0ml 混匀,28 保温5分钟,加入0. 2M pH4. 4 醋酸醋酸钠缓冲液1. 0ml置28 保温10 分钟,加2. 0ml pH8. 6 Na2HPO4 中和。（2）UV 处理取HNO2 处理后的孢子液在纤维素琼脂平板上分区、划线、接种,用30W 紫外灯,相距30cm 照射5 分钟、10 分钟、15 分钟,置28 培养1015 天。UV 照射5 分钟的10 天后开始生长,菌落有深绿色、绿色、黄色、白色。而照射10 分钟和15 分钟者均未生，挑取各种类型的单个菌落转种斜面，经过复筛,选出高产菌。115 菌种的复筛羧甲基纤维素琼脂培养基: 羧甲基纤维素钠10g, (NH4)2SO4 4g, KH2PO4 2g, MgSO47H2O 0.5g, 蛋白胨1g, 琼脂20g, 蒸馏水1000mL。菌种选择时可选用和铺菌法，铺菌法是在分离平板上铺一层单一的实验菌的办法可用来测定各个菌落的抗生素生产能力。复印平板法是将菌落复印在平板上的办法来研究它们对一系列实验菌的。本实验可选项用复印平板法即将分离纯化的各菌株分别接种到羧甲基纤维素琼脂培养基以及滤纸条培养基上进行复筛, 根据平板上菌落的生长情况以及滤纸条的崩溃程度选出优良的纤维素降解菌。12菌种的保藏菌中保藏是选好菌落后的又一较重要的工作，菌中保藏的原理是运用人工的条件使微生物的生长代谢活动降到最低，以减少变异。一般保存的方法有：斜面冰箱保存法，沙土管保藏法，石蜡油封存法等方法。由于本实验的实验菌产孢微生物，使用沙土管保藏法，具体方法是：将沙与土洗净烘干后过筛，按沙与土的比例为（12）：1混合均匀，分装高度约1CM左右，121度间歇灭菌三次，一般沙用80目过筛，土用80100目过筛。然后将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置与干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱保存。2 培养基的配制21 培养基的配比原则在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：要素：H2OC+能源N源P、SK、Mg生长因子含量：(10-1)(10-2)(10-3)(10-4)(10-5)(10-6)从中可以看出：水分含量最高，这是因为微生物多数是水生性的，它们的aw值(详后)高；碳源的含量其次，这是因为碳元素在任何细胞有机物中都是含量最高的，同时，碳源还兼有能源的作用，而能源的消耗量是很大的；N、P、S、K、Mg的含量依次递减，这是与它们分别在细胞组分中的含量是相符的；生长因子的量最少，这是与它的生理功能相一致的。22 培养基成分 培养基的成分大致分为碳源,氮源,无机盐,微量元素,特殊生长因子,促进剂,前体和水等几大类。对不同的微生物,微生物不同的生长阶段,不同的发酵产物以及不同发酵工艺条件等,所使用的培养基都是不同的,这些也都是培养基配制需要考虑的因素。221碳源 碳源是构成菌体细胞的骨架和发酵产物分子的骨架，同时也是微生物所必需的重要能源。纤维素发酵大多采用含有纤维素的原料作为碳源。国内常用的粗纤维原料有稻草、秸秆、玉米芯、纸浆、麸皮、糖醛渣等。222 氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物。常用的氮源可以分为两大类：有机氮源和无机氮源。常用的有机氮源有花生饼粉，黄豆饼粉，棉子饼粉，玉米浆，玉米蛋白质，蛋白胨，酵母粉，鱼粉，尿素，废菌丝体和酒糟等。它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢。有机微生物对氨基酸有特殊的需要。玉米浆是一种很容易被微生物利用的良好氮源，因为它含有丰富的氨基酸，还原糖，磷，微量元素和生长素等。本试验用到的氮源有：硝酸铵、玉米浆、花生粉、豆粉、玉米胚芽粉、尿素等。在发酵过程中，要注意碳氮比的合理搭配，因为低碳氮比将导致培养初期菌体的过快生长和对碳源消耗过快，而高碳氮比将由于氮源不足而出现菌体生长繁殖太慢。223 无机盐及微量元素微生物在生长繁殖和生产过程中，需要某些无机盐如：磷酸盐、钾、镁、锰、铁盐以及氯化物等。微量元素如磷，镁，硫，钾，钙，铁，氯，锰，锌，钴等，以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物，这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。而不同的微生物及同种微生物在不同的生长阶段对这些物质的最适浓度要求均不同。在纤维素酶的发酵中应加入以下的盐类：钾、钙、镁、锰、钴盐等224 水水是所以培养基的主要组成成分，也是微生物机体的重要组成成分。因此，水在微生物代谢过程中占着极其重要的地位。微生物的营养物，代谢物，氧气等都必须溶解于水后才能通过细胞表面进行正常的活动。此外，由于水的比热较高，能调节细胞内的温度。同时水又是一种热的良导体，有利于散热，可调节细胞温度。水源质量的主要考虑参数包括PH值，溶解氧，可溶性固体，污染程度以及矿物质组成和含量。同时由于所用菌株为真菌，故所需的水活度值应较低。225 生长因子，前体，产物促进剂,诱导物生长因子，从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸，嘌呤，嘧啶，维生素等。生长因子不是对于所有微生物都必须的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。在纤维素酶发酵过程中加入适当的诱导物可以增加酶的产量。纤维素、纤维寡糖及其他结构类似物均可作为纤维素酶的诱导物，所以在发酵过程中应加入这些物质。23 培养基的灭菌生物化学反应过程中，特别是细胞培养过程，往往要求在没有杂菌污染的情况下进行，这是由于生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物质，因而很容易受到杂菌污染，进而产生各种不良后果：由于杂菌的污染，使生物化学反应的基质或产物消耗，造成产率下降；由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或使产品质量下降；污染的杂菌可能 会分解产物而使生产失败；污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的PH，从而使生物化学反应发生异常变化；发生噬菌体污染，微生物细胞被破裂而使生产失败等。231 灭菌方法所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。应用的范围有：（1）培养基灭菌；（2）气体灭菌；（3）设备及管道灭菌等。常用的灭菌方法有：化学灭菌；射线灭菌；干热灭菌；湿热灭菌和过滤灭菌等。本实验采用湿热灭菌。24湿热灭菌湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌。由于蒸汽有很强的穿透力，而且在冷凝时放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭各种微生物。 一影响灭菌效果的因素微生物的种类和数量，培养基性质、浓度、成分，灭菌的温度、时间。二热阻：微生物对热的阻抗能力。三灭菌原理 对数残留定律：经加工灭菌，死亡微生物速度和存在的微生物数量成正比。26 微生物的死亡速率与灭菌时间培养基湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡速率与残存数量成正比即dN/dt=kN其中K,N,t分别是，活的微生物，微生物受热时间，比死亡速率。培养基灭菌时间的衡算为t=1/K*LnN0/Ns,但培养基灭菌时间过长或灭菌温度过高都会影响培养基成分的破坏，所以灭菌时应以瞬时高温灭菌为宜。 25培养基的连续灭菌培养基的分批灭菌的缺点是对培养基成分破坏大，升降温时间长，而连续灭菌时培养基在短时间内被加热到灭菌温度，短时间保温后被快速冷却，再进入早已灭完菌的发酵罐，这样不但可以节省时间，更重要的是减少了培养基的破坏率。连续灭菌的流程图2. 6 空气灭菌发酵过程中空气质量的好坏直接关系到发酵的顺利进行，所以在发酵过程中要想顺利进行就必须提供处理过的空气，即标准的无菌空气。处理空气的基本流程图是：空气灭菌流程图在处理空气时应注意采风塔的选取，采风塔应建立在工厂的上风头，远离烟囱，越高越好至少10米。在图中第一部分是粗过滤器和压缩机，第二部分是储罐，第三部分是冷却器，第四部分是旋风分离器，再往后依次是丝网除沫器加热器和空气过滤器。这样经过几步的处理空气就可以通入发酵罐了。3 扩大培养过程在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段：（1）实验室种子制备阶段（2）生产车间种子制备阶段31实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：液体培养法和固体培养法。对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。311斜面种子培养基PDA 培养基：马铃薯去皮后,切碎煮沸30 min ，然后用双层纱布过滤，滤液内加入葡萄糖及琼脂，融化后补充水至要求体积。312液体种子培养基葡萄糖10 g/ L ,蛋白胨1 g/ L ,营养盐溶液50mL/ L , Mandels 微量元素盐溶液1 mL/ L ,110 mol/ L醋酸缓冲液调pH 4.8 。营养盐溶液组成( g/ L ) ； (NH4) 2SO4 14 , KH2PO44 20 ,CaCl2 2H2O 4 ,MgSO4 4。313摇瓶产酶培养基葡萄糖5 g/ L ,蛋白胨1 g/ L ,Mandels 微量元素盐溶液110 mL/ L ,吐温80 1.0 mL/ L ,用H2SO4 调pH。产酶用碳源品种及浓度根据实验需要而定,营养盐的加量按一定的C/ N 加入。营养盐与微量元素盐溶液的组成同种子培养基。上述培养基在121 下湿热灭菌30 min。32、生产车间种子制备321种子制备在装有50 mL 液体种子培养基的250 mL 三角瓶中,用孢子接种器在里氏木霉斜面种子上挑取1 环孢子,在30 ,150 r/ min 摇床上培养2 d ,作为液体种子。322摇瓶发酵培养按一定的接种量接入盛有100 mL 产酶培养基的500 mL 三角瓶中,在回转式摇床中培养27 d ,每个做2 个平行样。3.3 发酵罐培养3.3.1产酶培养基使用外购的秸秆,加水在配料槽配成固形物为3 %的发酵液,用H2SO4 中和至pH 4.5 。营养盐的加量按C/ N = 81 加入。营养盐与微量元素盐溶液的组成同上。上述培养基在121 下湿热灭菌60 min。3.32从种子罐接种（如下图）发酵罐接种时，一般发酵常用的接种量为5%10%，选择合适的接种量对酶产酶有很大的影响。接种量过低时，产酶活性不高并使生长周期延长，采用较大的接种量可缩短菌体生长达到高峰所需的时间，从而使纤维素酶的合成担前。但是，接种量过大，则导致曲中生物量增长迅速，曲温度升高，不利于产酶。同时接种龄对产量影响也很大。一般，以菌种对数生长期的后期，也就是培养液中菌的浓度接近高峰时所需的时间为佳。太短则会使前期生长缓慢，延长整个发酵周期；太长则会使菌体过早衰退，导致生产能力的下降。所以将培养48 h 的液体种子,按10 %种量接种于发酵培养基中。3.33发酵过程装液量为罐容积的70 % ,于28 培养,控制通气量为0.21 vvm ,用调频装置调整转速为120150 r/ min ,并通过流加2 mol/ L NH4OH 控制发酵液pH 大于40 ；通过控制风量和转速,保持适当的溶氧饱和度,并通过流加消泡剂控制发酵过程中形成的泡沫。发酵过程中每4 h检测1次各项生化指标,包括还原糖浓度、菌体生长情况、pH 值、酶活等。当发酵液pH不再下降或回升,并伴随发酵液粘度明显降低,作为终止发酵的依据。发酵结束时,发酵液经板框分离,可得发酵上清液。4 发酵罐的设计 41 发酵罐的工艺尺寸 根据实验产量为2吨，产纤维素酶的发酵周期为5天，清理发酵罐总时间为一天，一年工作日为300天，产纤维素酶的产量为10g/l现估算发酵罐的大小如下。设实验用1个发酵罐，发酵液收率约为95%，预处理收率约为90%，提取时收率约为90%，精制时收率约为82%，提取总收率为85%*90%*82%=62.8%取63%，装料系数为70%，估算发酵罐的体积为：V=2*106*6/（300*0.95*0.63*0.70*10）=9.55取10立方米。42 发酵罐的结构如图:其中取H/D=2 ；d/D=0.5 ；W/D=1/8 ；B/D=1； (s/d)2=2.5根据衡量结果作图如下：H 发酵罐筒身高 D 发酵罐内径 d 搅拌器直径 W 挡板宽度B 下搅拌桨距底部的距离 S 两搅拌桨间距 HL 液位高度V0（公称体积）=VC（筒身容积）+VB（底部）=D2H4+0.15D2圆柱部分的容积为V2，V2=D2hb4+D2ha6(ha=0.25D) 全容积V全=V1+2Vb=D2/4H+2(hb+D/6)取H=2D,hb可忽略 所以V全=1.8D3=10m3所以D=1.77m 由此可算出H=3.54m；W=0.22m；B= 1.77m； d=0.89m ； s=1.4m 1-三角皮带转轴；2-轴承支架；3-联轴节；4-轴封；5-窥镜；6-取样口；7-冷却水口；8-夹套9-螺旋片；10-温度计接口；11-轴；12-搅拌器；13-底轴承；14-放料口；15-冷却水口；16-通风管；17-热电偶接口；18-挡板；19-接压力表；20-手孔；21-电动机；22-排气口；23-取样口；24-进料口；25-压力表接口；26-窥镜；27-手孔；28-补料口。发酵罐的管路分布图43 发酵罐的灭菌 发酵罐的灭菌可采用空罐灭菌和实罐灭菌：空罐灭菌将所有的通气口都稍微打开然后通入热水蒸汽让水蒸气尽量通过每一个角落以达到灭菌的效果。具体方法是130，4560min，直接蒸汽法。冷却系统水应排净（夹套与盘管）。实罐灭菌方法是：1预热（8090），2直热（蒸汽）（120、30min）（全进全出原则），3待空气压力高于罐内压力时，通入空气。（即待罐内压力降到低于空气压力后导入无菌空气。）5 发酵过程的控制 51 发酵过程补料策略发酵可分为：分批发酵，补料-分批发酵，半连续发酵和连续发酵。本试验可以采用分批发酵，即一次性加如发酵罐内等发酵完全后放罐，但由于发酵过程微生物的代谢和产品的增多，都会引起发酵罐内温度，PH值和各种能源物质等因素的变化，如果不加以控制那么会直接影响微生物的生长以至于影响发酵，所以在发酵的整个过程中要监控各个量的变化，给与适当的调整使微生物能够正常的代谢。加碳源最好根据排气中氧气及二氧化碳量来控制一般在残余量降至0.6%左右时，PH上升时加碳源，补氮是指加硝酸铵，氨，尿素，使发酵液氮源控制在0.01%0.05%,补前体以使发酵液中残余诱导物浓度为0.05%0.08%。52 发酵过程PH值的控制在初始pH4.05.5 范围之内,里氏木霉产纤维素酶较为稳定,但pH 较低时产酶周期，不同浓度葡萄糖对产酶的影响延长,当pH 为4.5 时产酶最高。发酵液的PH值变化，与发酵的关系密切相关，对菌体的生长繁殖和产物的积累的影响极大，因此是一项重点检测的发酵系数，纤维素酶在发酵过程中的最适PH是6.57.2。如果pH值过高产纤维素酶细胞壁的厚度会减少，如果过低，菌丝的长度会缩短。pH值的调节可采取加酸碱的方法，也可以通过采用控制某些料液的速度加以控制，在纤维素酶的发酵过程中可以采用控制碳源和氮源的加料速度及比例来调节。任何微生物都有一个适合生长的pH范围。因此，培养初期以及培养过程中的pH值直接影响微生物的生长和酶的合成。用木霉生产纤维素酶时，pH值应在45.5之间。53 发酵过程温度的控制在纤维素酶发酵过程中，菌体生长和产物合成均与温并有密切关系，但两者的最适温度往往不相同，一般情况下，产酶的最适温度低于生长温度。培养温度较低时有利于纤维素酶的合成，但产酶时间较长；培养温度较高时产酶时间缩短，但会严重抑制纤维素酶的合成。28 是产酶的最佳温度;温度低时,产酶周期延长。但28 并不是菌体生长的最佳温度,木霉最佳的生长温度为3031 。所以应采用变温培养，前期（24小时）培养温度为3536，中后期培养温度为2830，能有效地促进纤维素酶的合成，在时间达到72小时时酶活力达到最高值。54 发酵过程氧的控制在好氧深层培养中，氧气的供应往往是发酵能否成功的关键因素之一即使培养基内空气饱和，它所储存的氧仍很少 加大通气量， 适当降低温度， 提高压力， 补水提高搅拌转速，一般在发酵初期，菌体少，溶氧量可以少些；菌体生长旺盛时耗氧多，通风量要大些；产酶时需强烈通风。同时也可用搅拌，以利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于酶的生成；同时也可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，从而提高溶氧量，增加空气利用率。55 发酵过程泡沫的控制泡沫大都是由蛋白质等易起泡的成份所引起。分为正常泡沫和异常泡沫。正常泡沫：1前期：由于营养成份丰富而起泡，这类泡沫只要菌丝迅速生长，泡沫自然消除。2末期：细胞自溶而起泡，预示着应尽快放罐。 异常泡沫：1前期长时间泡沫不能下降，说明菌体可能不能正常生长，应在促进生长上解决问题，若在消泡上下功夫，将导致更不好的后果，这种情况下，应以人工消泡为主。2中期起泡，预示着异常发酵的出现，处理方法将视具体情况而定。消沫剂在发酵工程是不可缺少的控制剂，但应越少越好，不可盲目使用，否则，其作用是相反的。56 染菌的控制发酵染菌的原因分析及防治措施，发酵过程的染菌原因有：1 渗漏；2 空气系统；3 输料（物料）系统（种子带菌、补料带菌）；4 灭菌系统（料结快导致消不透等）； 5操作系统（倒压、死角等）。一但染菌根据染菌情况放灌或调节各种因素使发酵条件远离杂菌，本实验是酶的发酵染菌的应注意各个环节。若前期染菌应重新灭菌，加入培养基；若中期，则应调节发酵条件，抑制杂菌的生长；若后期，则应放罐。57 发酵过程中废气的处理 发酵的过程中产生的废气，可能含有对环境不利的因素，所以不能直接排入大气中，而且废气中的二氧化碳可以再利用，所以应考虑到废气的处理。58 发酵过程热量的衡算 Q生成=Q+Q散+Q显-Q搅拌+CdT/dt其中Q生成=V的平方dt/R在（0t）的积分6 下游加工粗酶粉发酵上清液粗酶液20%(NH4)2SO4SephdexG-75柱盐析,3000r/min层析pH6.0,0.1离心10minmol/L柠檬酸-柠檬酸钠洗脱纤维素酶活性峰DEAE-Sephadex沉淀弃去上清液A-25柱层析,pH7.83000r/min离心0.2mol/L磷酸缓冲液6%(NH4)2SO4洗脱DEAE-SephadexA-25柱层析, pH3.0,0.1mol/L沉淀上清液弃去柠檬酸-柠檬酸钠洗脱透析浓缩纤维素酶活性峰透析干燥浓缩干燥粗酶粉纯纤维素酶纤维素酶的下游加工流程图61 发酵液的过滤和预处理过滤：采用鼓式真空过滤器，过滤前加去乳化剂并降温。预处理就是除去高价离子和蛋白质，对高价离子的去除可以采用草酸或磷酸，加草酸时它与钙离子生成的草酸钙，还能促使蛋白质沉淀，加磷酸既能降低钙离子也能降低镁离子。对于蛋白质的沉淀可以加入絮凝剂，调节PH值或加热。在此发酵过程中我们加入20%(NH4)2SO4盐析,3000r/min离心10min，然后去沉淀，留上清夜。即可除去杂蛋白和大部分杂质。62 纤维素酶的提取粗酶制备：菌种孢子斜面孢子悬液种子罐发酵罐发酵液盐析离心上清液盐析沉淀离心浓缩干燥粗酶粉。纤维素酶的过程的要求是：时间短，温度尽可能低，PH值适宜，同时还应该保持酶的活性，针对这些要求我们可以采用6%(NH4)2SO4盐析，3000r/min离心，去上清夜，留沉淀。所得沉淀经透析，超滤浓缩和喷雾干燥。具体步骤见下游加工流程图。63 纤维素酶的精制纤维素酶的精制是最后一道工序，此工序对纤维素酶的纯度要求较高。粗酶粉溶解为粗酶液，然后SephdexG-75柱层析，可用pH 6.0，0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠洗脱；然后用DEAE-SephadexA-25柱层析， 可用pH7.8，0.2mol/L磷酸缓冲液洗脱；再用DEAE-SephadexA-25柱层析，pH3.0，0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠洗脱。精制中可以选用以下步骤：透析，超滤浓缩，干燥。干燥时为了保证酶的活性，可以用喷雾干燥。这样就可以得到纯纤维素酶。得到纤维素酶, 其比活力为0.28 u/m g; 经过Sephadex G275 柱层析, 其比活力