亚麻酸对糖尿病大鼠炎症介质和氧化应激的影响_张利华.pdf

基金项目 国家自然科学基金资助项目 81070184 30800447 收稿日期 2011 02 18 修回日期 2011 06 24 v 通讯作者 TelE mail zlh1204 sohu com A 亚麻酸对糖尿病大鼠炎症介质和氧化应激的影响 张利华1v 张 薇2 韦广洪2 杨 沛3 刘 军2 牛晓琳2 1 第四军医大学唐都医院老年病科 2 唐都医院心血管内科 3 第四军医大学口腔医学系 陕西 西安 710032 摘要 目的 观察A 亚麻酸 ALA 对糖尿病大鼠体内炎症介质和氧化应激的影响 探讨 ALA 在糖尿病防治中的 作用 方法 雄性 SD 大鼠高脂饮食喂养 4 周后 腹腔注射链脲佐菌素 STZ 30 mg kg 建立 2 型糖尿病 T2DM 模 型 将大鼠随机分为 3 组 n 10 正常对照组 糖尿病模型组和 ALA 治疗组 500 Lg kg d 4 周后测定大鼠血清 中肿瘤坏死因子 TNF A 可溶性 P 选择素 sP selectin 可溶性细胞间黏附分子 sICAM 1 一氧化氮 NO 丙二醛 MDA 的含量以及超氧化物岐化酶 SOD 和过氧化氢酶 CAT 的活性 结果 与正常对照组相比 糖尿病大鼠血清 中炎症介质TNF A sP selectin 和 sICAM 1的含量增加 血清 NO 含量下降而MDA 升高 同时抗氧化酶 SOD 和 CAT 的 活性降低 ALA 治疗可显著降低糖尿病大鼠血清中TNF A sP selectin 和 sICAM 1的含量 与STZ vehicle 组相比 P 0 01 增加血清 NO 水平并减少 MDA 含量 升高抗氧化酶 SOD 和 CAT 的活性 与 STZ vehicle 组相比 均 P A 亚麻酸 糖尿病 炎症介质 氧化应激 中图分类号 R587 1 文献标识码 A 文章编号 1000 6834 2012 01 064 04 Effects of alpha linolenic acid on inflammation and oxidative stress in the diabetic rats ZHANG L i hua1 v ZHANG Wei2 WEI Guang hong2 YANG Pei3 LIU Jun2 NIU Xiao lin2 1 Department of Geriatrics Tangdu Hospital the Fourth Military Medical University 2 Department of Cardiology 3 Department of Oral Medicine the Fourth Military Medical University Xi an 710032 China ABSTRACT Objective To investigate the effects of alpha linolenic acid ALA on inflammation and oxidative stress in the diabetic rats Methods An experimental type 2 diabetes mellitus modelwas induced by feeding male SD rats with diet of high fat for 4weeks and then in jected them intraperitoneally with streptozocin STZ at 30mg kg Then the animalswere randomely divided into three groups n 10 con trol group diabetic group and ALA group Four weeks later tumor necrosis factor TNF A soluble P selectin sP selectin soluble inter cellular adhesion molecule 1 sICAM 1 nitric oxide NO production malondialdehyde MDA superoxide dismutase SOD and catalase CAT in the serum were determined Results Inflammatory agents including TNF A sP selectin and sICAM 1 increased in diabetic rats to compare with control group Treatmentwith ALA significantly decreasedTNF A sP selectinand sICAM 1to compare with diabetic group Fur thermore compared with control group serumMDA production increased whereas NO production SOD and CAT activities decreased in dia betic rats Treatment with ALA reduced MDA production increased NO production promoted SOD and CAT activities comparedwith diabetic group Conclusion These results indicate that diet rich inALA exerted the ant i inflammatory and ant i oxidative effects in diabetic rats which may be beneficial to the prevention and treatment of diabetes KEY WORDS alpha linolenic acid diabetes inflammation oxidative stress 糖尿病是当前威胁人类健康的严重慢性疾病之 一 长期的高血糖引起全身多系统的代谢障碍 导致 大血管和微血管的病变 出现严重的心 脑 肾 眼 神经等的并发症 严重影响糖尿病患者的生活质量 甚至危及生命 大量的研究表明炎症介质和氧化应 激在糖尿病和糖尿病并发症的发生 发展过程中起 到非常 重要 的作 用 1 A 亚麻 酸 alpha linolenic acid ALA 是一种植物来源的 n 3必需脂肪酸 是长 链 n 3 不饱和脂肪酸二十碳五烯酸 eicosapentaenoic acid EPA 和二十二碳六烯酸 ducosahexenoic acid DHA 的前体物质 近年的临床试验表明 膳食补充 ALA 对糖尿病 心血管疾病的预防和治疗有着重要 意义 但其作用机制不清 3 4 本实验拟观察 ALA 对糖尿病大鼠血液炎症介质和氧化应激的影响 探 讨 ALA 在糖尿病防治中的作用及其机制 64 Chin J Appl Physiol 2012 28 1 1 材料与方法 1 1 材料 ALA 由第四军医大学药物研究所自椒目中分离 纯化所得 含量达 91 6 95 2 链脲佐菌素 streptozotocin STZ Sigma 公司 肿瘤坏死因子 tu mor necrosis factor alpha TNF A 可溶性 P 选择素 soluble P selectin sP selectin 及可溶性细胞间黏附 分子 soluble intercellular adhesion molecule 1 sICAM 1 的酶联免疫吸附实验 enzyme linked immunosorbent assay ELISA 检测试剂盒为美国 Biosource Interna tional 公司产品 一氧化氮 nitric oxide NO 试剂 盒 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase SOD 试剂 盒 丙二醛 malondialdehyde MDA 试剂盒 过氧化氢 酶 catalase CAT 测试盒均购自南京建成生物工程 研究所 1 2 方法 1 2 1 糖尿病大鼠模型的建立及分组给药 雄性 SD 大鼠 体重 130 150 g 采用高脂饲料 10 猪油 10 蛋黄粉 0 1 胆盐 1 维生素 78 9 基础饲料 喂养 4 周后禁食 14 16 h 给予大鼠腹 腔注射 STZ 30 mg kg 临用前用 0 1 mol L 柠檬酸缓 冲液配成 1 的 STZ 溶液 每天注射一次 连续 2 d 2 1 周后取各组动物尾静脉血监测血糖水平 以 2 次随机血糖 16 7 mmol L 作为 2型糖尿病 type 2 diabetes mellitus T2DM 模型成功的标志 继续高脂 饲料喂养 4周以稳定模型 全体实验动物共分为 3 组 n 10 1 正常对照组 Control 正常雄性 SD 大鼠 普通饲料喂养 大鼠 每日按 500 L l kg 以 0 01 酒精灌胃 将糖尿病模型复制成功的大鼠随 机分为 2 糖尿病对照组 STZ vehicle 高脂饲料 喂养 每日按 500 L l kg 以 0 01 酒精灌胃 3 ALA 治疗组 STZ ALA 高脂饲料喂养 ALA 以 500 L g kg d 以灌胃方式给药 参照 Suresh Y 等 5 方法 100 Lg ALA 溶于 100 Ll 0 01 酒精中制成灌注液 整 个实验期间 全部动物自由饮水和进食 4 周后 三 组大鼠禁食12 h 断头法处死各组动物 收集血液 分离血清备用 血清中 MDA 含量 SOD 和 CAT 活 性 均按说明书上的操作要求进行测定 1 2 2 空腹血浆血糖及胰岛素水平的检测 空腹血 浆葡萄糖测定采用葡萄糖氧化酶法 胰岛素用放射免 疫分析法测定 具体操作步骤按试剂盒说明进行 1 2 3 血清TNF A sP selectin 及 sICAM 1 含量的测 定 采用夹心 ELISA 方法 按照试剂盒说明进行操 作 具体方法如下 取稀释 100 倍的血清 100 Ll 加 入特异性单克隆抗体包被的微孔板 于 37bC 孵育 1 h 洗板 3次 再加稀释后的生物素标记抗TNF A sP selectin 或sICAM 1 的抗体50 Ll 室温下孵育 1 h 加 辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素 100 L l 室温下 孵育30 min 加 100 L l TMB 底物 避光 室温下孵育 12 15 min 加 100 Ll 2 mol L H2SO4 终止反应 分 光光度计 波长 450 nm 测定吸光度并计算 1 2 4 血清中 NO 含量测定 按试剂盒要求采用 Griess 呈色反应及比色方法进行测定血清中 NO 含 量 以NaNO2为标准品作标准曲线 用分光光度计 测定吸光度 540 nm 并进行计算 1 3 统计学分析 采用 SPSS 11 0 统计软件进行统计学分析 实验 数据均以均数 标准差 x s 表示 组间数据比较 采用单因素方差分析 ANOVA 若总体差异显著 再 以 SNK q 检验分析相应两组间的显著性差别 2 结果 2 1 ALA 对糖尿病大鼠血糖和血清胰岛素的影响 与正常对照组 Control 相比 糖尿病组大鼠的 空腹血糖和血清胰岛素水平均明显增加 与糖尿病 组大鼠 STZ vehicle 相比 ALA 治疗组大鼠空腹血 糖和血清胰岛素水平无显著差别 表 1 Tab 1 Fasting blood glucose and serum insulin concentration of diabetic rats after treated with ALA x s n 10 Group FBG mmol L INS mIU L Control6 76 0 923 78 2 02 STZ vehicle 17 3 0 6 40 13 3 11 STZ ALA 16 8 1 3 32 17 2 26 STZ Streptozotocin ALA alpha linolenic acid FBG Fasting blood glucose INS Insulin P 0 05 P 0 01 vs control 2 2 ALA 对糖尿病大鼠血清 TNF A的影响 与正常对照组 Control 相比 糖尿病组大鼠 STZ vehicle 血清中 TNF A水平显著增加 P 0 01 饮食补充 ALA 可显著降低糖尿病大鼠血清 中TNF A水平 P 0 05 图 1 2 3 ALA对糖尿病大鼠血清可溶性黏附分子的影响 与正常对照组 Control 相比 糖尿病组大鼠 STZ vehicle 血清中 sICAM 1 图 2 和 sP selectin 图 3 水平明显增加 P 均 0 01 糖尿病大鼠经 饮食补充 ALA 后 血清中 sICAM 1 和 sP selectin 水 平显著降低 P 均 0 01 其中 sICAM 1 尤为显 著 同 STZ vehicle 组相比约降低 34 65 中国应用生理学杂志 2012 28 1 Fig 1 Effect of ALA on serum TNF Ain diabetic rats P 0 01 vs control P 0 05 vs STZ vehicle Fig 2 Effect of ALA on serum sICAM 1 in diabetic rats P 0 01 vs control P 0 01 vs STZ vehicle Fig 3 Effect of ALA on serum sP selectin in diabetic rats P 0 01 vs control P 0 01 vs STZ vehicle 2 4 ALA 对糖尿病大鼠血清氧化应激的影响 与正常对照组 Control 相比 糖尿病大鼠血清 MDA 含量增加 而血清 NO 水平 抗氧化酶 SOD 和 CAT 的活性显著降低 P 均 0 01 与 STZ veh i cle 组相比 饮食补充 ALA 可显著降低糖尿病大鼠 血清 MDA 含量 同时增加血清 NO 水平 升高 SOD 和 CAT 的活性 P 均 0 05 表 2 3 讨论 近年来 糖尿病的炎症学说日益受到关注 认为 T2DM 是一种自然免疫和低度炎症性疾病 2 6 细 胞因子如TNF A的产生是机体出现炎症反应的标志 Tab 2 Oxidative stress of diabetic rats after treated with ALA x s n 10 GroupNO Lmol L SOD U ml CAT U ml MDA Lmol L Control4 87 0 4628 81 8 1222 32 6 190 25 0 03 STZ vehicle 3 21 0 32 13 16 5 29 12 29 3 21 0 47 0 08 STZ ALA3 95 0 26 17 34 6 21 17 15 5 56 0 32 0 06 NO Nitric oxide SOD Superoxide dismutase CAT Catalase MDA Malondialdehyde P 0 01 vs control P 1 Bloomgarden Z T Inflammation and insulin resistance J Diabetes Care 2003 26 5 1619 1623 2 蒋朝晖 吕玉晶 赵 芳 等 高脂高糖饮食结合链脲 佐菌素建立 2 型糖尿病大鼠模型的改良 J 中国比 较医学杂志 2011 21 1 1671 7856 3 Djousse L Pankow J S Eckfeldt J H et al Relation be tween dietary linolenic acid and coronary artery disease in the National Heart Lung and Blood Institute Family Heart Study J Am J Clin Nutr 2001 74 5 612 619 4 Winnik S Lohmann C Richter E K et al Dietary a l pha linolenic acid diminishes experimental atherogenesis and restricts T cel l driven inflammation J Eur Heart J 2011 2 10 1093 5 Suresh Y Das U N Long chain polyunsaturated fatty acids and chemically induced diabetes mellitus effect of omega 3 fatty acids J Nutrition 2003 19 3 21