肿瘤的免疫疗法.docx

肿瘤的免疫疗法 理论上讲人体每天都有大量细胞发生突变。但只有极少数的细胞能够继续分裂生长，并且逃脱免疫系统的监视和攻击而形成肿瘤。只有真正明了其中的原因，才能寻找出对抗肿瘤的策略。目前，人们已发现了各种各样影响肿瘤免疫的因素。1、肿瘤细胞的弱免疫原性：免疫原是指能诱导机体产生免疫应答的物质，通常免疫原的来源与应答者之间在种系进化过程中相距越远，免疫原性就越强，如细菌、病毒等对于人体来讲就具有强的免疫原性。但肿瘤来源于机体自身突变的细胞，大部分的成分与机体正常细胞的成分相同，只有极少数异常表达的蛋白质和畸形多糖具有免疫原性。从早期的研究中人们就了解到，致瘤病毒诱发的肿瘤免疫原性最强，化学致癌物诱导的肿瘤免疫原性次之，动物自发性肿瘤的免疫原性最弱。由于肿瘤细胞之间也存在免疫原性不同的差异，那些免疫原性较强的肿瘤可以诱导有效的抗肿瘤免疫应答，易被机体消灭，而那些免疫原性相对较弱的肿瘤则能逃脱免疫系统的监视而选择性地增殖，这一过程称为免疫选择，经过不断的选择，肿瘤的免疫原性越来越弱。抗肿瘤抗体与肿瘤细胞表面抗原复合物的内化或脱落的这种抗原调变(antigenic modulation)作用，致使肿瘤抗原减少，免疫原性减弱。肿瘤细胞表面抗原还可被某些分子所遮盖，如包括唾液酸在内的粘多糖，肿瘤细胞表面通常比正常细胞表面表达更多的糖脂和糖蛋白。MHC I类分子递呈功能的缺乏常常是导致肿瘤免疫逃逸的主要原因之一，可由MHC I类分子mRNA转录水平的降低，基因组的丢失，b2微球蛋白基因的突变等引起。Restifo等人研究了大量人肿瘤细胞系，发现这些细胞内抗原加工和呈递所必需的LMP-1、LMP-2、TAP-1、TAP-2四种蛋白的mRNA表达低下或无法测出。还有人测定了76例宫颈癌TAP-1的表达，其中37例无TAP-1表达。这具有一定的普遍意义。IFN-g处理的肿瘤细胞可逆转上述缺陷。共刺激分子的缺乏也是肿瘤逃逸的原因。研究较多的是共刺激分子B7。它主要表达在激活的B细胞表面。在树突状细胞、IFN-g激活的巨噬细胞上等也有B7分子表达，而在肿瘤细胞表面的表达缺如。肿瘤细胞可以通过其表面的MHC分子将肿瘤抗原直接递呈给T细胞，由于缺乏共刺激信号，不能激活T细胞，相反却诱导产生了T细胞耐受。T细胞除可能被肿瘤诱导产生免疫耐受外，还可能出现克隆删除。FasL或Fas抗体与细胞表面的Fas分子结合会诱导该细胞的凋亡。T细胞表面一般都表达Fas分子，有些肿瘤细胞会表达FasL，它们与浸润到肿瘤周围的T细胞上的Fas结合，导致这些T细胞的凋亡。2、T细胞缺陷：长期以来，研究人员还发现肿瘤宿主的T细胞在体外对有丝分裂原的反应性降低，体内的迟发性超敏反应也降低。近些年来研究表明这是由于肿瘤宿主的T细胞缺陷所致。MHC分子递呈的抗原肽与T细胞受体结合后需经TCR/CD3以及一系列信号传导系统，最后才能激活相关的基因而发挥生物学功能。CD3分子由g、d、e、z和h五种链组成，与TCR共价连接，肿瘤患者T细胞CD3分子的z链常常表达下降，且信号传导过程中涉及到的p56lck和p59fyn等分子的表达也会出现异常，这都会导致T细胞的活化障碍。这种T细胞障碍在体外用CD3和CD28分子的单抗以及IL-2刺激，可以使之恢复。3、抑制性T细胞（Ts）：目前尚无证据表明Ts是T细胞的亚类。以前认为Ts属于CD8+T细胞，目前对抑制性T细胞的认识有所变化，也更加复杂化。它既可以是CD8+T细胞也可来自CD4+T细胞。一些Ts作用是抗原非特异性的，如CD4+Th1和Th2辅助性T细胞各自产生细胞因子非特异性地抑制对方。肿瘤宿主可增强这种非特异性免疫抑制。Ts通过释放的可溶性TCR，可溶性IL-2受体，及免疫抑制因子（如TGF-b、IL-10等）抑制抗肿瘤免疫。Ts也可以是高度抗原特异性的。一些研究表明：抗原特异性抑制是由细胞毒性T细胞介导的，它们识别辅助性T细胞TCR上的独特决定族，并且破坏这些细胞。另一些研究证实：CD4+ Th1细胞毒性细胞识别APC上的抗原，并破坏APC。还有研究证实：分离荷瘤宿主体内激活的 gdT细胞，体外培养后产生抑制CTL活性的CTL-抑制因子（CTL-IF）。4、抑制性巨噬细胞(sM?)：过渡活化的巨噬细胞可抑制淋巴细胞的增殖，抑制NK和CTL抗肿瘤活性。sM?是否为巨噬细胞的分化阶段，还是其中的亚类尚不清楚。5、抗原呈递功能障碍：研究表明荷瘤宿主外周血获得的抗原呈递专职细胞DC往往对抗原呈递有障碍。而取自荷瘤宿主骨髓细胞在体外与GM-CSF、IL-4、TNF-a共同培养扩增的DC抗原呈递功能良好，表明肿瘤宿主的DC可能从骨髓释放到体内的成熟过程中受到了荷瘤宿主体内某些因素的干扰而削弱了对肿瘤抗原的呈递作用。6、免疫抑制因子：带瘤动物和肿瘤患者的免疫抑制状态常可随肿瘤的切除而消失。经检测，多种动物和人类肿瘤的提取物、血清及建系的肿瘤细胞培养上清中存在免疫抑制因子，主要有TGF-b，IL-10和PGE2等。细胞因子在免疫网络中的作用也是极其复杂的。一种因子可有多重作用，如IL-1、TNF-a和IFN-g既有促进抗肿瘤的作用，又有促进肿瘤转移和发展的一面。TGF-b：转化生长因子b (transforming growth factor-b)，是迄今发现的最强的肿瘤诱导产生的免疫抑制因子，多种肿瘤分泌TGF-b，在很多肿瘤的宿主血浆中也发现有TGF-b。TGF-b在动物实验中能促进肿瘤的侵犯和转移。它能对抗IL-2引起的免疫刺激作用，抑制NK和LAK细胞的活性，IL-2受体的表达，抗原特异CTL的诱导产生及T、B细胞的增殖反应。有些肿瘤分泌TGF-b的量还与它们的进展和预后有关，分泌TGF-b多的肿瘤患者预后较差。用TGF-b的抗体或TGF-b反义核酸处理能中和TGF-b的抑制作用，在动物实验中能降低肿瘤的转移能力。IL-10：机体的免疫功能通过正向和负向调节两方面彼此协调，相互制约而取得自稳，T辅助细胞就可以分为两个亚群Th1和Th2，Th1亚群的细胞主要分泌IL-2和INF-g，具有正向调节功能，Th2细胞主要分泌IL-4和IL-10等，具有负向调节功能。IL-10是一种重要的负向调节因子，在很多人类肿瘤中都有过量表达，如肾癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤及神经母细胞瘤等。IL-10的过量分泌会导致负向调节功能增强，打破机体的平衡。PGE2：PGE2是免疫反应的生理调节因子，活化的巨噬细胞和许多肿瘤产生前列腺素，如人的乳腺癌，头颈部癌中的PGE2水平明显增高。PGE2能引起免疫抑制。它能诱导产生抑制性T细胞和抑制性巨噬细胞，降低LAK细胞的活性，抑制CD3单抗诱导的细胞增殖等。上面提到人的肿瘤细胞表面的MHC分子表达的下降和缺失是肿瘤免疫逃逸的因素之一，而PGE2能下调癌细胞表面的HLA-DR分子。在体内和体外的实验中，用PGE2合成的抑制剂可以增强抗肿瘤免疫反应。PGE2所产生的抑制作用是与计量相关的，在高剂量时通常呈现免疫抑制作用，而抗体的产生，Th的产生是需要低剂量的PGE2。七、 肿瘤的免疫诊断由于单克隆抗体技术的发展，结合放射免疫测定（ridioimmunoassay，RIA）酶免疫测定（enzyme immunoassay）免疫荧光测定（Immunofluorescence assay，IFA），肿瘤的免疫诊断被广泛研究。所检测肿瘤的靶抗原五花八门，可以是细胞的分化表型（淋巴瘤，白血病的分期），抗体的独特型表位（B细胞肿瘤），胚胎性抗原（CEA消化道肿瘤、AFP肝癌），各种肿瘤相关性抗原（c-erbB-2/P185乳腺癌、卵巢癌，MUC-I腺癌），细胞的正常产物（PSA前列腺癌，P53多种癌）。然而，绝大多数的测定是作为肿瘤辅助诊断，判断肿瘤的转归、复发意义较大，极少作为肿瘤的早期诊断。值得重视的是放射免疫指导外科（radioimmunoguided surgery，RIGS）。肿瘤外科手术有些难以确定肿瘤的浸润的深度，具体边缘及隐藏的部分。RIGS 恰好能解决上述难题。该方法是将标记放射性同位素标记的肿瘤相关抗原的抗体，注射到体内进行显像分析，它可以准确定位肿瘤浸润的范围。它是目前肿瘤定位显像最好的方法。经美国FDA批准已将该方法用于人结直肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌的临床研究，其中包括了基因工程单链抗体（single chain Fv，scFv）的应用。一般抗体均大于150KD，不易渗透到组织中，而鼠源抗体用于人体易产生人抗鼠Ig抗体。应用基因工程技术产生的单链抗体是由Ig重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段小肽连接在一起的重组蛋白。分子量仅为27KD，免疫原性降低，易于进入瘤组织，血中半衰期短，易于清除，无Fc段不会与具有Fc受体的正常细胞结合，并且易于产业化。为了提高显像效果Nieroda 用生物反应调节剂 g-干扰素与同位素标记抗体同时使用，促使肿瘤细胞自身抗原呈递作用增强，在细胞表面提供更多的靶抗原，结果明显增强了显像效果。八、 肿瘤的免疫治疗（一）、细胞过继免疫治疗肿瘤免疫治疗的复苏开始于八十年代中期。如第一节概述中所提到的Rosenberge用LAK和TIL细胞过继免疫治疗肿瘤，在肿瘤研究领域引起轰动。1985年，他首次报道了应用LAK和IL-2联合静脉输注治疗25例常规疗法治疗无效的晚期肿瘤病人，11例治疗有效肿瘤明显缩小，其中一例黑色素瘤完全缓解。此后又开创了TIL过继免疫治疗。但是，其代价昂贵，LAK、TIL治疗剂量高达1x1010-1x1011细胞，IL-2每日输入高达1x107国际单位。主要的副作用来自大量使用IL-2引起的毛细血管渗漏性综合症。八十年代末LAK、TIL风暴席卷了我国，此间尝试了各种治疗方案，其中包括异体LAK、胎儿LAK、肿瘤局部注射，协同其他生物反应调节剂（BRM）、化疗药物等降低IL-2使用剂量。至今，除了LAK、TIL以外还报道了A-LAK（粘附性LAK）、CD3AK（IL-2和抗CD3抗体共同诱导激活淋巴细胞）、TAK（在前者基础上加入肿瘤抗原提取物）、CIK（多种细胞因子诱导的杀伤细胞）等。从临床疗效来看，这些方法对癌性腹水治疗效最好，对黑色素瘤、肾癌、淋巴瘤有效率一般为20-30%，对于其他肿瘤的疗效相对较低。这种生物治疗的优点是：体外诱导效应细胞避开了肿瘤宿主存在免疫抑制，易于活化和扩增。活化的杀伤细胞在体内可以产生抗肿瘤效应，并且与现在的常规治疗方法有互补性。其缺点是：不能产业化生产，制备繁琐，质量控制较难，成本高，治疗有效的瘤谱不够广泛。（二）、重组细胞因子治疗由于生物工程的发展，生理条件下难以获得的细胞因子可以被大量生产。有一批基因重组细胞因子已成为正式的药物，与肿瘤治疗相关的有IFN、IL-2、G-CSF、GM-CSF，并有大量的基因重组细胞因子在进行临床研究。IFN-a是最早进入临床的基因重组细胞因子，对毛细胞白血病的缓解率可达60%-90%。对于慢性白血病、淋巴瘤、Kaposi氏肉瘤、急性白血病、多发行骨髓瘤、神经胶质瘤、肾细胞癌的部分和完全缓解率分别可达50%、37%、26%、24%、20%、17%、16%。1989年Rosenberg总结了单独使用rIL-2治疗的130例肿瘤患者，对于黑色素瘤、肾细胞癌的有效率分别为24%和22%，对其他肿瘤无明显疗效。骨髓移植配合低计量IL-2皮下注射可降低血液恶性肿瘤的复发率。有关细胞因子联合应用（rIL-2 x rIFN-a、rIL-2 x rTNF-a），以及联合化疗治疗肿瘤的结果尚不统一，既有协同增强疗效的结果，也有无差异的结果。G-CSF和GM-CSF对于肿瘤患者主要用于化疗所至粒细胞减少和骨髓移植。目前GM-CSF还用于DC的扩增以及协同瘤苗使用。IL-1是天然的内热源、TNF-a 又是恶质素，临床实验毒副作用较高，基础研究表明两者也有促进某些肿瘤发展或转移的作用。一般认为IL-12是较好的抗肿瘤免疫因子，临床研究显示具有抗肿瘤疗效，但是还没有使人感到惊奇的结果。IL-15和IL-18是有潜在的临床应用前景的新细胞因子，有待于进行临床研究。（三）、基于抗体的免疫治疗生物导弹是一个理想的思路，应用毒素、放射性同位素、化疗药物与肿瘤相关抗体连接由静脉注入体内，使药物集中于瘤内，既增强疗效又减少对机体的毒副作用。但是体内实验与理想的结果差距较大，关键问题是抗体与正常组织的交叉反应，以及鼠源单克隆抗体在人体内易产生人抗鼠Ig的抗体。对于后者人们通过基因工程方法构建单链抗体，它比抗体分子小6倍，易于进入瘤组织，消弱了免疫原性。近期抗肿瘤血管生成治疗肿瘤是研究热点之一。动物模型中用抗血管生成因子（FGF-B、VEGF）抗体封闭血管内皮生长因子取得了抑制肿瘤生长作用，此法有待于临床验证。根据4-1BB/4-1BBL共刺激通路，应用抗4-1BB抗体在小鼠体内可直接活化T细胞，根除某些已种植的大肿瘤，此方法尚需进一步扩大研究。抗erbB-2癌基因产物抗体作为生物药品已进入市场，配合化疗用于抗肿瘤治疗，获得较好疗效。（四）、免疫基因治疗体内注射大剂量重组细胞因子时可获得一定疗效，但是也可以产生严重的毒副作用，如IL-1、IL-2、TNF-a、IFN。采用细胞因子基因导入免疫效应细胞（如TIL）虽然分泌量不大却能提高体内抗肿瘤免疫效应。也有将细胞因子、共刺激分子等基因通过重组病毒、脂质体、基因枪直接导入体内的肿瘤组织中进行表达，其中包括多基因导入，本质是利用原位肿瘤诱导抗肿瘤免疫，方法简便、经济。如将异体HLA-B7/b2-为球蛋白基因经阳离子脂质体包裹后，注射于黑色素瘤局部，在四个I期临床研究中36%产生作用，19%诱发全身抗肿瘤反应，对于其他肿瘤临床效果不明显。也有将细胞因子基因导入正常细胞，如纤维母细胞，以及裸基因直接肌肉注射或通过基因枪导入体内，并持续表达细胞因子，免除体内反复注射细胞因子。在已种植肿瘤的小鼠模型中应用基因枪将IL-2、 IL-4、IL-6、IL-12、IFN-g、TNF-a 或GM-CSF导入表皮细胞，其中IL-12最为有效。美国匹兹堡大学癌症研究所，用IL-12基因转染的人成纤维细胞注入体内，在33例肿瘤患者中12例在2-3个月内肿瘤明显缩小。（五）、肿瘤疫苗肿瘤疫苗是主动免疫的主要内容，分为细胞瘤苗、亚细胞瘤苗、分子瘤苗和基因瘤苗四种类型。1 细胞瘤苗：细胞瘤苗是一种最古老的瘤苗，但仍有优越性，因为自体肿瘤细胞包容了所有自身肿瘤抗原。早期的细胞瘤苗只将肿瘤细胞用射线或化疗药物灭活，一般只配合佐剂卡介苗（BCG）使用，临床效果参差不齐，远期疗效多数不理想。九十年代初，Schriimacher应用禽类新城鸡温病毒（NDV）处理自身瘤细胞瘤苗已在临床上沿用至今，在小鼠淋巴瘤模型中NDV瘤苗可防止50%的肿瘤转移，临床研究中明显延长了生存期。应用NDV起到了较好的佐剂效应，对人体无不良反应。近期正在研究NDV细胞瘤苗结合双功能抗体（抗NDV上的凝血素神经氨酶HN x CD28、HN x CD3）的抗肿瘤效果。同期，我国钱振超教授应用NDV细胞瘤苗同时加入中药莪术提取物 b-榄香烯处理，动物实验有明显抗肿瘤效果，临床应用也取得了一定疗效。近些年转基因细胞瘤苗研究较多，其中转导的基因包括：IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、TNF-a、G-CSF、GM-CSF、IFN-g基因；共刺激分子（B7-1、B7-2、）基因；同种异体抗原（HLA-B7）基因等。因肿瘤和宿主的情况不同，以及方法学的差异，结果不一致，其中IL-2、IL-12、GM-CSF、HLA-B7基因转导的瘤苗效果相对较好。另一策略是去除肿瘤的免疫抑制，提高免疫效果。如应用IL-2基因和TGF-b反义基因联合导入的肿瘤疫苗能有效激活免疫系统和抑制肿瘤生长。采用APC细胞（B细胞、DC）与肿瘤细胞融合相当于多基因转导，可弥补肿瘤细胞中抗原呈递功能的缺陷，补充了共刺激分子。用该融合细胞免疫动物可治愈已形成的亲代肿瘤。我国学者用GM-CSF基因转导的DC与肿瘤细胞融合免疫效果更佳。2亚细胞瘤苗细胞瘤苗必须经过可靠的灭活才能用于免疫，否则会产生种植。从实体瘤分离完整的细胞需要用酶进行消化，得率较低。而直接裂解细胞，获取细胞粗提成分极为简单，进入体内也更安全。如应用同种异体黑色素瘤细胞裂解物在I、II期临床研究中客观反应率达20%，长期存活达8%。国内学者应用IL-2基因重组痘苗病毒转染小鼠黑色素细胞瘤，将其裂解的沉淀物作为瘤苗治疗荷瘤鼠，明显延长了生存期。近期发现DC分泌的exosomes（外泌小体）属于亚细胞结构，具有多种抗原呈递分子和T细胞共刺激分子。肿瘤抗原肽刺激的DC产生的exosomes能够呈递肿瘤抗原，活化CTL，抑制和根除已建立的小鼠肿瘤，所以exosomes瘤苗极具发展潜力。3分子瘤苗：伴随着肿瘤抗原、抗原呈递、T细胞识别机制研究的突破性进展，分子瘤苗发展极快。根据抗体与抗原的影响关系，制备抗肿瘤原独特型的抗抗体，作为独特型瘤苗，在临床上也见到一定疗效，单克隆抗体在人体应用的共同问题是产生中和抗体，所以单区抗体、人源化抗体特型瘤苗也在研究中。为增强免疫效果将抗体与大分子载体（KLH等）偶联，以及与免疫增强因子合用更为有效。T细胞识别的MHC I分子呈递的小肽一般仅有*个氨基酸。肿瘤抗原小肽用酸性液体可从肿瘤细胞上洗脱。将抗原小肽与APC（B细胞、DC）灿螅剐母患贏PC上，该细胞在体内外均可诱导显著的抗肿瘤免疫作用。富集小肽的DC在体内用量小而效率高。对已知序列的抗原小肽可用人工合成方法获取，溶于DMSO溶剂中直接注入体内可诱导抗肿瘤免疫反应。但是，也有实验表明：单纯注入肿瘤抗原肽可诱导免疫耐受，促进肿瘤发展。用DC呈递这些小肽，可获得较好的免疫效果，在体外也可从健康人周血淋巴细胞中诱导出肿瘤特异的CTL。国外一研究组用多种抗原肽或肿瘤提取物处理DC治疗16例黑色素瘤，其中11例出现肿瘤抗原特异的迟发超敏反应（DTH），2例部分缓解，3例完全缓解。对于激素治疗无法控制的33例前列腺癌，应用HLA-A2限制性前列腺特异的膜抗原PSM-P1 和 PSM-P2处理的DC治疗后，阳性反应率为30%，其中6例部分缓解，2例完全缓解。有效率达24%。肿瘤抗原肽可以产业化生产，不会有肿瘤种植的危险，不存在肿瘤细胞的抑制成分。缺点是此类抗原肽是受MHC限制的，MHC I分子相同的患者才能用同一种小肽，并且已知抗原肽尚少，对不均一的肿瘤，缺乏免疫所用抗原肽的肿瘤，便会逃避免疫的攻击。随着T细胞识别肿瘤抗原表位的不断发现，合成肽疫苗的应用会不断扩大。肿瘤细胞内的HSP（HSP70、HSP90、HSPgp96）参与抗原的加工处理，它们结合了所有的肿瘤抗原肽。将结合肿瘤抗原肽的HSP提取后，作为瘤苗，可活化肿瘤特异性CD8+CTL，产生抗肿瘤作用。由于HSP不具多肽性，因此，这种疫苗不受MHC限制。也有人证实从肿瘤中纯化的HSP70或HSP70高表达肿瘤免疫后，在体外可扩增出大量高杀伤活性的 CD4-、 CD8-、TCRgd+ T细胞，此杀伤细胞不受MHC限制，正常细胞的HSP70则不能产生该反应，所以它们识别的是HSP70与抗原复合物。由于肿瘤不表达或低表达MHC I 、II类分子，因此HSP-多肽复合物诱导抗肿瘤免疫倍受关注。4基因瘤苗基因瘤苗在临床研究中也初见端苗，以往认为不能作为肿瘤排斥性抗原的CEA，将其基因插入痘苗病毒进行体内免疫可以诱导CTL杀伤CEA阳性的肿瘤细胞。把已知T细胞识别的肿瘤抗原小肽基因串联在一起插入病毒载体也是一种较好的瘤苗方式。用癌基因erbB2/neu质粒DNA免疫小鼠可将降低erbB2/neu高表达肿瘤的生长和转移。基因疫苗的优点是：基因疫苗在体内可以不断产生抗原刺激免疫系统；易于诱导CTL；基因疫苗不与染色体DNA整合，使用安全；摄入DNA不能使宿主产生抗DNA抗体；可大量生产，不需低温保存。缺点是：目的基因表达水平不理想；长期低水平表达抗原可能引起免疫耐受