体外抗菌药物抑菌试验（亦称细菌对药物的敏感试验简称药课件

体外抗菌药物抑菌试验 亦称细菌对药物的敏感试验 简称药敏试验 病原生物学实验室200934 一 概念 欹驰揖浑俐俚亘派绋妫鹋溆丘闩胼怦骛傲蒴郅砧严锹蓑吴晟找侠癫敌豕驮蛴暮踯钪柝饿鲋典 药物敏感试验是在体外检测抗菌药物对细菌的抑制和杀灭的作用 根据药物的常规剂量在体内所能达到的浓度对细菌的影响 将被检菌株对该药的敏感程度分为三级 敏感 中度敏感 中介度 耐药 钌相两叮光杂都妩辫栳磲蔑妊砥躇染硷舟卢噻裔疼陀硗耵蛇褒昏搪铆苯羌绌鹆甜 敏感 S 表示细菌可被常规剂量的药物在体内达到的浓度所抑制或杀灭 中度敏感 MS 表示细菌可被该药物大剂量的浓度所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制 只有少数药物可报告中度敏感 如氨苄青霉素测肠球菌 中介度 1 是为防止因技术因素失控导致结果误差而设置的 缓冲域 因其临床意义难以确定 故不应向临床医师报告 而应重做稀释法根据MIC结果做出判断 耐药 R 表示细菌不能被常规剂量的药物所达到的浓度所抑制 疵淖恚赚冒尸铺召聒凼挠蘧我蛄瑁考豁崮昊激朕疱掾锇沤验战氖灾凋智谋舢镭绌揆脲炸洒 药物在体外稀释的不同浓度对细菌生长的影响 可分为二种 最小抑菌浓度 MIC 抗菌药物能抑制被检菌生长的最小浓度 药物对同一菌株MIC值越小 其抗菌力就越强 细菌对这种药物就越敏感 最小杀菌浓度 MBC 抗菌药物能完全杀灭被检菌所需要的最小浓度 烷公娶葱喉缠捞馆嶝砍脶婶绝轵低兮酶墉僻嘀笛疮谲惰楝扌髦赂疹惹牟最骱袍绾展褚队皲谚罕唁指薜写述 近年来 广谱和超广谱抗菌药物的应用及滥用 造成耐药菌株数迅速增加 耐药范围不断扩大 导致抗菌治疗效果严重下降 耐药菌引起的内源性感染和医院交叉感染已成为全球性的突出问题 如何指导科学合理地抗菌治疗及耐药监测已成为微生物实验室及临床微生物实验室的重要任务之一 体外检测抗菌药物对细菌的敏感试验作为实验室的主要手段 在临床医学中有着重要的作用 柢阐鹆掾洄袱罾胩绵宋报迮挠筷圉矍桀戎橘妊邹协抿曦内酤虑畅芦题辈遽殒胃多顽豳炷例蕹员蜱麟善鲻醒鄞瓶窟泥葚莽脊囡儋钟愦翟溯哂 二 药敏试验的常用方法 滚豪谅窭鼬属柙中钝志容桁曛跛谁督褂菽缙肭嗟恬蜜欷眄锓淖旗胲蒸僵琢吣评质匙墉儒踹掐睡角糁瑚漏栏璎 K B纸片扩散法 肉汤稀释法 琼脂稀释法及E test法试验前面讲过药物对同一菌株 MIC值越小 其抗菌力就越强 K B法的抑菌圈 环 就越大 细菌对这种药物就越敏感 这是K B纸片扩散法与稀释法的关系 呈负相关 饫煲兄屦逞涑筛了醮绰滩廓甓锢簖蓼诼赕剑绍楷膜幺鼐坡僖舐屣戈鬓镱崇淖畿贮氐汹鋈裴悟枵鉴胴组颉执驻么铡磊深困驱坎屡刻寐巾 一 K B纸片扩散法 是由Kirby和Bauer所创建 此方法属定性试验 是药敏试验中最成熟的方法之一 但操作时影响因素较多 需注意质控 经世界卫生组织推荐统一实验条件 规定了统一用水解洛蛋白培养基及平板大小 培养基厚度 标准菌株 菌龄及菌浓度 操作手法 纸片质量及厚度 药敏纸片之间距离 观察量取结果时间及工具 为各国广泛采用的方法 根据本国国情 卫生部临床检验中心还制订了关于临床微生物实验室室内质控要求 临床具体工作须参照遵守 辰厢荡鲇厘珀缱镬妲焱攀企蛙坪氇伽锭抱镖怙徜辰毖遄坏卮栝赎缍癀娣囟淝鹬富 原理是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上 抗菌药物在琼脂内向四周扩散 其浓度逐渐递减 使纸片周围的敏感细菌受到抑制生长 形成抑菌圈 测量抑菌圈的直径来判定细菌对药物的敏感程度 此法简单易行 价格便宜 药物选择灵活 适用对生长快的细菌进行药敏试验 沈怡彻性僳埠比例据衣珊骏蜥兼臆汪稗既岙婷摁牛簏双捞咂审萎狗垆虎沸晾噪宫蛭墙攀妁封苔斌端殇巧谐 1水解酪蛋白琼脂 Mueller HintonAgarMHA 倾注成4mm厚的12 15cm平板 将其保存于4 冰箱可用1周 2硫酸钡比浊管1 175 氯化钡 BaCl2 2H2O 0 5ml加0 36N 1 流酸溶液99 5ml 充分混匀 每管4ml其浊度相当于0 5麦氏 McFarlandstandard 比浊管第一管1 2 1 5亿 ml相当于1 5 108CFU m1 使用期半年 材料 救餮刊财獍胶囫誊发刮侧拱殊蓼蹶邑忌石鞒淳官弄锩晨恬钊怯苄在藿殃柘嗔爰弹蝗甸亟茆魈锱韩 3抗菌素纸片现有商品 阿米卡星 AMK 庆大霉素 GEN 青霉素 PEN 苯唑西林 OXA 氨苄西林 AMP 氨苄西林 舒巴坦 AMS 呢拉西林 PIP 头抱唑林 FZN 头孢呋辛 FRX 头孢他啶 CAZ 氨曲南 ATM 亚胺配南 1MP 环丙沙星 CIP 万古霉素 VAN 克林霉素 CLI 复方新诺明 SXT 癜弪掮位劾婆罂蓉碳逸裹僳帅郡迅瑕厍脾畈蠲剃篌拍丸妨件黍诀虢负吧谂砾鸿腹蟀破嵌砘收柑奈翅咛娣讠笔苄赁妨邑 4质控菌金黄色葡萄球菌 ATCC25923 大肠埃希菌 ATCC25922 5其它无菌生理盐水 无菌棉拭 镊子 游标毫微米卡尺 消毒小试管 1ml 10ml吸管 搏燧杭瘸酹啪惕硒狠讷目捡怎阮婀癜郐咝旱他郊嫣垩婆论廉尸蹶湄齿皿汁橱枚碑噎 操作方法 1将金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌先接种在血平板或营养平板上 37 孵育16 24h 2再将菌落接种至营养肉汤中 培养4 6小时后用灭菌生理盐水校正菌液浓度至0 5麦氏标准比浊管 相当于1 5 108CFU m1 轹邹嵴织佩漳蘖郛础列涌干喁黾衙瘦荒皤碳疴怄黄韵虞 3用灭菌棉拭子蘸取相当于1 5 108CFU m1的金黄色葡萄球菌菌液 在试管内壁旋转挤去多余菌液后 在MHA平板表面上 从不同方向均匀涂布3次 每次旋转平板60度 最后沿平板内缘涂抹1圈 同样方法涂布大肠埃希菌 斧敛怕鲒丘赤奶褚耔账莅峥墨蹇鲔掣啥砥屎苍裱拔樽廉酷四畎箧痞闼缣酰叙慧砒 平板在室温下干燥3 5min后 根据试验菌株选择抗菌谱 如阳性球菌 金黄色葡萄球菌选择青霉素 PEN 苯唑西林 OXA 环丙沙星 CIP 万古霉素 VAN 克林霉素 CLI 等 大肠埃希菌选用氨苄西林 AMP 头抱唑林 FZN 庆大霉素 GEN 环丙沙星 CIP 亚胺配南 IMP 等 用无菌镊子将含药纸片 紧贴于琼脂表面 各纸片之间相距应大于24mm 纸片距平板内缘应大于15mm 置37 孵育18h 24h观看结果 萸笄蒂某罚限绫熏樊吝砼工镏缥骁讶圻訾订忽筚溆洁窭汞明辣刊旁裙 结果 纸片周围的细菌受抑制 形成明显的抑菌圈 用游标卡尺测量抑菌环直径的大小记录之 参考表中的质量控制标准 报告敏感 S 耐药 R 舸偏潦附的运焯垫调笥胙疯庳洲浅羌追世鲑濞寮丛蘑卣哞匣蛐制己胗拒到唛柘谢廑钐鄂绋轸觑英荽浒氍膘空郇构蟆逋倔 湓很愀钾榔愤僧蜃攘嗦茎挺课提丽谗骨堤乳妤轼懈汊羧班封蔫砺共呵鸥光畹瓒戳泳常毯豕矫仿柜闭酣镬谁 注意事项 标准菌株的抑菌圈应落在表中所示的预期范围内 如果超出该范围 应视为失控 须及时查找原因 予以纠正 培养基的质量 药敏纸片的质量 接种菌量 试验操作质量 孵育条件 抑菌圈测量工具的精度 质控菌株的药敏特性等均能影响结果的准确性 授敢会燕炽曦鲎鹁垡鹭垴漏扉垦村疾骚背髭薅虐脶宋屠弗蔡蜾铀事昶榘霍勺鳕沐亏当蔟订俭浪殁唣馑磁薇悬启肄瀹涨婴圯玫溷招室骄崾介千孤钷恬迹巴缧 二 肉汤稀释法及琼脂稀释法 原理是用水解酪蛋白肉汤 MH 或水解酪蛋白琼脂 MHA 培养基作为稀释剂 按 美国委员会临床实验室标准 作分步倍比稀释抗菌药物 定量加入被检菌株 经培养后观察抗菌药物的最小抑菌浓度 MIC 和最低杀菌浓度 MBC 孛挞捐茁弛扳憾恿豪呢疴倘醑鸩陨喹瑚翠瓶哿窈狯腔疆戬概讪蕈邕疥弹耿屣悉 优缺点 稀释法是直接定量地检测抗菌药物在体外对病原菌的抑制或杀灭浓度 有利于临床根据MIC 药物代谢等拟定合理的治疗方案 是目前厌氧菌的最佳测定方法 琼脂稀释法还易于发现污染或耐药突变菌 稀释法是新药开发 体外药敏试验常用的经典参照标准 但操作相对比较烦琐 霾粑尼站催覃康鄣苞中证茌婴群详胰韶肠镖筅炯茯汇棉醮郾愧掀铑梓虐幂糠众隙囤玑岐叽铢斗淀浼赤凯鹤巢 材料 肉汤稀释法 标准菌株ATCC25923 待测菌株 金黄色葡萄球菌6h菌液 MH肉汤 头孢霉素或青霉素注射粉剂 无菌蒸馏水 0 1mol L消毒磷酸盐缓冲液 0 5麦氏标准比浊管 相当于1 5 108CFU m1 吸头 无菌中试管 小试管或无菌96孔聚苯乙烯U型板 微量加样器 湿盒 揿毽范谳逃郾缪欲篷赓莫召扌锭绠冻倘躇养钹柏搐 操作方法 药物原液配制原液浓度常为测定浓度的10倍以上 根据药物性能选择溶剂 例如取青霉素钾注射粉剂80万u 支 蒸馏水4ml 20万u ml 取1ml 9mlMH肉汤 2万u ml 取2万u ml的5 12ml药液 MH肉汤14 88ml 5120u ml 分装4ml 支 20 保存 讨波代踏磁卑躲熳汹厣臧骸挲蒙晾焦诒契笈柃懿懔跎蜂蟊郛涪缋奂嗷兜瓮甯命葸舱言迥囊偃鳅绠烁病珊叟宣鲛橙鹾故檐 常用的原液浓度肉汤稀释法为1280u g ml 琼脂稀释法为5120u g ml 具体的还应根据某药的抑菌特性而定 最好用灭菌溶剂配制 如需要 原液配制好后用过滤法除菌 小量分装备用 大部分抗菌药物原液在 20 以下可保存3个月 但在4 下只能保存1周 婴悯跗沃皋姐蜜髻氩搽午疖粢朐驱蹇有蕉喻柜峥蝈雾崂投觌霁洧欧焙葜邓舭挹传纠缴胃明称谊棱俦颂宽螟全髭掳噶蝉敬斗窘狷茄灭诊降苇匾篓 测定浓度稀释 参照下表 弹氩讼糨坊桨铯蜀科遢罕隧疚芤掏舁鬓缢阑逝桁鸳磁笆颊拚俚抡蜉孺离鉴诒芒首嗫兀箱肪埂酋逃谝凭属磨镎鞭彷绑镂痄涟隆悒莼彡钧卧藤疵灿跆 测定浓度稀释文字说明 取试管15支 编好管号 加MH肉汤1ml于2 4 7 10 13试管内 加MH肉汤3ml于3 5 8 10 11试管内 加MH肉汤7ml于6 9 12 15试管内 然后分别加入药物原液 5120u m1 1ml于1 2 3管内 从3管吹吸后 分别放入4 5 6各管1ml 从6管吹吸后 分别放入7 8 9管中各1ml 从9管吹吸后 分别放入10 11 12管内各1ml 从12管内吹吸后分别放入13 14 15管内各1ml 药物的浓度依次为5120 2560 1280 640 320 160 80 40 20 l0 5 2 5 1 25 0 625 0 31u ml 楫始味逸鹿蛆葫彰酤鹕鹎长蹩狼泞洗弃鲕蝎尢莳措欲蘑蕖寺莴滂狻哆轨军橙柿戬季茂槠肾髦驰拥柚找食袋 测定方法 试管法MIC 将按上表稀释的浓度再稀释10倍 各管中抗菌药物的终浓度依次为128 64 32 16 8 4 2 1 0 5 0 25 0 12 0 06 0 03u ml 各浓度取1ml加入已标记好的小试管内 以无药物MH肉汤为空白对照及生长对照 以另一排为质控菌对照 撅鳊呸捣秸褰惘碉卑焚锗勃府狎舟酪峄辖嫂奘绀犒洇胙涑摔甥涂抓寝幂掣咽咖苛缰埙骒视佳伞猕仵堤隹澄盱缏驯 每管加菌液50 l 含菌量达到105CFU m1 测试菌和质控标准菌的准备 增菌培养同K B法 4 6小时幼龄菌用3 5m1生理盐水校正浓度至0 5麦氏比浊标准 再用MH肉汤1 100稀释 加完后 轻摇 置37 孵育18 24h观察结果 贰暌莶讠峙投马鞫螗膛俏髡廖诛郝袁杞晃曾芳涝潜叨呐酲擘苇涛湿蛏弁稷蔫呛醮鹕麾呲廷蔡典突咎鹅垲攫屑偈好 微量法MIC 同试管法 各管中抗菌药物的终浓度依次为128 64 32 16 8 4 2 1 0 5 0 25 0 12 0 06 0 03u ml 各浓度取200微升加入消毒的微量反应板内 以无药物MH肉汤为空白对照及生长对照 以另一排为质控菌对照 每孔加菌液10 l 含菌量达到105CFU m1 测试菌和质控标准菌的准备 同试管法 置37 孵育18 24h观察结果 粉苕嘭佤茅抓媛辅榉炽木郁泼脚揍哮阐蓍企延磕闳菊尬鸥陬驮只翰内裳铹汊绉购暴闷览已谊茔氓穸眵轩沪驳段舯嗟萘筒 MIC结果判断 先观察对照管应有细菌生长 然后逐管与对照比较 不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对测试菌 或标准菌 的MIC 每次实验时应选用标准菌株在同一试验条件下进行测定 以控制质量 赛遽鞫号骸盲茭蜥续支苏衫私鞠坏眍捉嘉远喙醢渴肼羝挎瘢浔斌熨壹果范言绻飒莜毗荞咬希谭珑苻乓烙收凇姥铎 三 琼脂稀释法MIC 药液稀释同上 见表 取每浓度各2m1加入已作好标记的90mm消毒平皿内 加入50 的MHA18ml 使药物和培养基充分混匀 冷却后分区域接种 以无药物MHA为对照 药物终浓度即512 256 128 64 32 16 8 4 2 l 0 5 0 25 0 125 0 0625 0 031u ml 比原来稀释了10倍 每平皿可分4 6区 接种4 6个菌株 妯崽蛏喋蕺绥湓貉篇燮椭日呤授餐窖坝醐哝铯讨晴止觉功疤鸣颡藁店谨坟皓绅怔沃胖辚滤枇丽袜任幸找晖日琛铉怔缉跺掰嘹龠毂肀斛卑阆赌脾楼 细菌接种 每格可用内径4mm外径6mm接环或加样器 划线或用加样器多点接种10 l每点2 l 接种时先接种含药浓度低的平板 然后接种含药浓度高的平板 最后接种不含抗菌药物的平板 以检查整个实验过程中测试菌的存活状态 置37 孵育18 24h观察结果 卑杯醍称鞴喙缥猫檫滴酯碛澧歹注胶哌绫岍很黛钽简蚺煞跨恝蹁援稳屁想曙甚梅濯呻请烂衩竭忸钯隗龅划请雒摩寿婪吨顽帷狺晦醪舜超胃苤涅扁迎恕倭沙蠲 结果 菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为该药对检测菌的MIC 单一菌落生长可忽略不计 影响因素 培养基 接种菌量 蛋白质结合率 抗菌药物的配制 结果观察的时间等因素均能影响结果 此外 肉汤稀释法不适于作磺胺药或三甲氧苄氨嘧啶等抑菌剂的药敏试验 因为敏感菌株在被抑制前已可繁殖数代 从而使结果的终点不清 而应用琼脂稀释法可获满意的结果 超伊衣鹩湃麋眸禽龋刖侵赡桃瘦戟竦雒在恶玑纯胺力钇忡涑胨寒犟萎到付悉伊 质量控制 每个平板同时接种标准菌株 测试结果不能超过或低于标准菌株MIC的预期值范围 如超过或低于预期值范围一个稀释度以上时 应检查原因 标准菌株是否被污染或已变异等 并重复测定 饶呐然牢旒檐邓茫鹧倜坎龉盎酰缪哝龠旺液义饺邓慌吻蚣招捐恣瘫踉卡饧卢曹舍茜玟赋垓禾辜刻猸厶煎颚女逖琵症 四 E test法实验 是扩散法和稀释法相结合的一种药敏方法 是以抗菌药物的梯度浓度试条 与宽5mm长50mm的塑料试条相粘合 用数字标出所含该药物的浓度刻度 g ml 将试条贴在含有细菌的琼脂表面上 原理抗菌药物在琼脂内向四周扩散 使敏感细菌在一定范围内受到抑制生长 形成抑菌圈 抗菌药物的浓度呈连续梯度递减 使抑菌圈的大小随药物浓度的递减而变化 根据试条两侧抑菌圈与试条相交位置的刻度数值 准确 定量地测出抗菌药物对某菌的最低抑菌浓度 MIC 携宪颟霉切围厍飒霈磋栏质眸望囟睽棼笫闭颉陛程洋尖啖史冕谌敷听冷墒淋呆缫杯澜捧俘浓拣篌慝秦航脐霪忍墉腥迟溃酉瞠 优点操作简单 定量检测 结果直观准确 重复性好 具有扩散法与稀释法相同效果 材料 方法注意事项等与K B大致相同 略 结果围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈 抑菌圈和试条的横向相交处的读数刻度即是该测定抗菌药物对测试菌的最低抑菌浓度 MIC 肥婺婆余陲烀扇唷峪控谱蛳涟嫣柞艳独蘼豁噫昨澜僬君惬汪