Northern 杂交试验计划报告.doc

Northern 杂交试验一 植物总RNA的提取1）准备工作 （1）RNase-free水的制备：用去离子水加DEPC（焦碳酸二乙酯），使其终浓度为0.01%，过夜搅拌，121高温灭菌30min，烘干备用。 （2）枪头及离心管：用含0.1%的DEPC的去离子水浸泡过夜，枪头盒及装离心管的容器用三氯甲烷擦拭2贬，121高温灭菌30min，烘干备用。 （3）研钵及其他所需玻璃器皿：在180烘箱中烘烤4h. （4）80%的乙醇：用RNase-free配置即可。 （5）所使用的移液枪及其他无法灭菌的仪器均使用三氯甲烷擦拭几遍。 （6）所用到的其他试剂：异丙醇和无水乙醇都应该是未开封的。 （7）其他所用到的溶液均用DEPC水配制。主意：试验操作整个过程中都要带上口罩和手套，接触到有可能造成RNase污染的物品时要黄手套，操作尽量迅速。2）实验步骤（1）将-80保存的拟南芥植株称量后（约200mg）迅速转移至用液氮与人的研钵中，加入液氮，不间断的研磨植物组织直至成细粉末即可。（2）加入400微升Buffer R-I,继续研磨直至样品完全融化，并且裂解液呈透明状。（3）见匀浆液转移至离心管中，加入150微升的Buffer R-II，漩涡振荡15 s/次，2次。（4）12000rpm 4离心5min。（5）小心吸取上清液，转移新的离心管中（切勿吸取沉淀）。（6）12000rpm 4离心5min。（7）加入250微升异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀，放置5 min。（8）转移溶液于复合离心管的内管中，6000rpm 4离心1 min。（9）弃滤液，加入500 微升 Buffer W1A于复合离心管的内管中，12000rpm, 4离心1 min。（10）弃滤液，加入700 微升 Buffer W2于复合离心管的内管中，12000rpm, 4离心1 min。重复一次相同的操作。（11）弃滤液，12000rpm, 4离心1 min。（12）将内管转移到一新的离心管中，往内膜中央加100微升Buffer TE。室温放置1 min后，12000rpm, 4离心1 min，洗脱液即为所提取的植物总RNA。注：脱盐液以上用到的溶液（试剂盒提供） Buffer R-I：细胞裂解液 Buffer R-II：平衡液 Buffer W1A：清洗液，须实验前加相应量无水乙醇后使用 Buffer W2：，须实验前加相应量无水乙醇后使用 Buffer TE：10 mM Tris-HCl,0.1 mM EDTA,PH 7.5RNA样品质量分析：完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。植物总RNA中28S rRNA及来18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。3）mRNA的纯化及cDNA的合成（1）纯化 DNase I 处理(DNase I,RNase Free) 在微量离心管中配制下列反应也，全量200微升。总RNA 50ug 10DNase I Buffer 20ulDNase I（RNase-Free，5U/ul） 8ulRNase Inhibitor(40 U/ul) 2ulDEPC H2O up to 200ul37恒温，650rpm震荡反应30min（eppendorf,Thermomixer compact）(以下用E.Z.N.A.TM mRNA Enrichment kit,R6511-01 进行纯化) 加200ul mRNA Binding buffer,混匀。 转移混合液于含50mg oligo (dT)纤维素的离心管中，充分混匀。 70水浴孵育3min。 室温26，1200rpm振荡孵育30min。 将泥装混合物转入复合离心管的内管中，26，12000rpm离心1min。 弃去外管中的滤液，加500ul Mrna Washing Buffer于内管中，用力上下颠倒混匀，26，1200rpm振荡孵育30min。 弃去外管中的滤液。转移内管于新的外管中，加400ul mRNA Elution Buffer（70预热）与内管中，用力上下颠倒混匀，26，12000rpm离心1min。，收集滤除液于新的2ml离心管重中，重复相同一次操作。 加1/10体积的3M NaAc(PH5.2)于洗脱液中，混匀。再加入等体积异丙醇，混匀，-20放置30min. 12000rpm，4离心30min。弃去上清液，12000rpm，4离心1min，用微量枪头吸去残留乙醇，通风橱，室温放置2到5min。 用 20ul RNase-Free溶解。（2）cDNA合成（用 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit,TaKaRa,Code D6110A,进行反转录）A 反转录 在Microtube 管中配制下列混合液总RNA 150ugOligo dT Primer(50uM) 1uldNTP Mixture（10mM） 1ulDEPC H2O up to 10ul混匀，PCR仪上按下列条件进行变性、退火反应65 5min,冰上急冻。 在上述Microtube 管中配制下列反转录反应液 上述变性、退火后反应液 10ul RNase-Free dH20 4.5ul5PrimeScriptTM Buffer 4ulRNase Inhibitor(40 U/ul) 0.5ulPrimeScriptTM RTase(200U/ul) 1ul混匀，PCR仪上按下列条件进行反转录反应。42 60min70 15min 1 cycles4 hoidB cDNA（反转录产物）的pcr检测用takara taqTM ,20ul 体系，拟南芥基因组DNA为对照，cDNA 为模板PCR产物检测：用1.5%琼脂糖凝胶，10ul PCR 产物加2ul 6X loading buffer 上样，100V恒压电泳25min。 二、Northern 印迹杂交1 原理知识及所用试剂A 探针准备DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1l/ ml、3l/ ml、5l/ ml ），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时，建议试验探针浓度50100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。B. 印迹条件对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10和20的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4或室温下过夜。C. 试剂及其配制MOPS缓冲液（10）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )（3-(N-吗啉基）丙磺酸） 50mmol/L NaAc 10mmol/L EDTA配置方法：准确称取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/Ld NaOH将调整pH 至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。上样染料： 50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝甲醛（37%溶液，13.3mol/L）适量核酸染料（1ml染料中加5微升）。染液： 0.5mol/L NaAc(pH 5.2)0.04%的亚甲蓝甲酰胺（去离子）70%乙醇SSC(20)： 3mol/L NaCl (175g/L) 0.3mol/L 柠檬酸三钠 用1mol/L HCl调整至pH 7.0Denhardt溶液（100)： 0.1% Ficoll 400（聚蔗糖400） + 0.1% PVP（聚乙烯基吡咯烷酮） +0.1% BSA，用DEPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml，于-20保存。预杂交溶液： 5 SSC 5 Denhardt 溶液 50%(w/v) 甲酰胺 1%(w/v) SDS杂交溶液：探针用预杂交液稀释成适当浓度2洗膜缓冲液：2SSC 加入0.1% SDS0.5洗膜缓冲液：0.5 SSC加入0.1% SDS0.1洗膜缓冲液：0.1 SSC加入0.1% SDS2 RNA变性琼脂糖凝胶电泳（1）将制胶用具用DEPC水冲洗一次，再用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。每一步操作都要戴上手套，以免RNase的污染。（2）在通风橱中安置好电泳槽和成胶槽及其梳子，因为在灌胶过程中有甲醛蒸气释放出来，刺激眼睛。配置琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。（3）待胶凉至60-70时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10MOPS缓冲液，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。拔出梳子前，在胶面上加入适量的1MOPS缓冲液（电泳缓冲液）覆盖胶面，小心拔出梳子使样品孔保持完好。（4）样品制备：取DEPC处理过的500l小离心管，依次加入10MOPS缓冲液2l、甲醛3.5l、甲酰胺（去离子）10l、RNA样品4.5l，混合均匀；将离心管置于60水浴中保温10min.，再置于冰上2min.；向每管中加入3l上样染料，混匀。（5）上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中（上样孔一侧靠近阴极），加入电泳缓冲液（1MOPS缓冲液），液面高出胶面12mm。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样2040l。（6）电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml2的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果3 转膜（1）在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DEPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2SSC（20SSC用DEPC-H2O稀释）中浸泡1530min.。（2）构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20SSC。（3）用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。（4）剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无RNase的水中浸泡5min.，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。（5）取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20SSC浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜46小时或4过夜。在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。（6）拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。（7）取下凝胶，用2SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。（8）紫外交联：将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外透射仪照射5min。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。对于湿润的尼龙膜，总照射剂量为1.5 J/cm2，而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15 J/cm2。（9）转膜效果检测：如果需要，可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入5%冰醋酸中，于室温浸泡15min.，再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温下浸泡510min.。可见明显的5s和18s两条RNA带，mRNA呈现模糊带型。4杂交建议杂交条件：探针浓度50-100ng/ml，温度68过夜。（1）将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中（每100cm2膜20ml预杂交液），封好杂交袋，在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。（2）将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性，立即使用)，用预杂交液稀释成设定浓度。（3）将杂交袋中预杂交液弃去，加入稀释好的含有探针的杂交液，在设定杂交温度条件下（68）杂交过夜。（4）杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的试管中，贮存于-70以备重复使用。重复使用时，解冻并在68下变性10min。（5）洗膜：杂交膜取出后用2洗膜缓冲液室温下洗膜2次，每次15min.，除去非结合探针以减少背景。接下来用0.5洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.，洗膜温度42，然后再在0.1洗膜缓冲液中洗膜2次，每次15min.，洗膜温度68。当探针长度小于100bp时，最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。5 化学发光法生物素标记的探针的检测：（以下试剂用量以10X10的膜面积为准。其他面积的膜另行计算）A. 37-50水浴完全溶解封闭液（Blocking buffer）和洗涤液(4washing buffer)。注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。B. 取一合适的容器加入16ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。C. 取50l Streptavidin-HRP Conjugate加入到16ml封闭液中(1:300稀释)，混匀备用。D. 去除用