硕士论文-昆虫蛋白质提取工艺的比较研究.pdf

吉林农业大学 硕士学位论文 昆虫蛋白质提取工艺的比较研究 姓名 潘怡欧 申请学位级别 硕士 专业 农业昆虫与害虫防治 指导教师 史树森 20050601 亩林表韭太学磺士学位论文昆虫蛋白提取工艺指标蚺电较研究 摘要 本试验以黄粉虫 T e n e b r i o m o l i t o r L 和黄褐油葫芦 T e l e o g r y l h d e r e l i c t u s G o m c h o v 为试验材料 通过对其鲜虫及去脂千虫的蛋白质提取方法及主要工艺 指标筛选的研究 以及昆虫蛋白质分离及其与传统蛋白源蛋白组份的比较 提出 了黄粉虫和黄褐油葫芦作为资源昆虫 其蛋白质提取最佳方法和各种方法的主要 工艺指标以及昆虫蛋白与传统蛋白的组分差异 为其有效开发和利用提供7 确凿 的科学依据 试验采用四种蛋白质提取方法 分别为碱提法 盐提法 胰蛋白酶 提蛋白法 T r is I t C I 提蛋白法 其中T r is H C I 提蛋白法为首次用于昆虫蛋白 的提取 对其主要工艺指标的筛选研究包括对不同浓度 抽提温度 抽提时问 固液比 及T r i s H C l 法的p H 值等 昆虫蛋白质的分离采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 方法 进行了电泳分离条件的筛选及与传统食用蛋白源 猪肉 鸡蛋和牛奶 的 蛋白质分离对比 试验结果表明 提取昆虫蛋白质时以鲜虫作为提取基质效果明 显优于使用去脂干虫提取昆虫蛋白质 以鲜虫为基质提取蛋白质 在四种方法中 胰蛋白酶提蛋白法的蛋白质得率最高 其次为碱提蛋白法和T r i s H C I 提蛋白法 盐提蛋白法得率最低 其中前两者水平相当并与后两者差异显著 以干虫为基质 提取蛋白质 各种方法的蛋白质得率由高到低的顺序与鲜虫一致 但胰蛋白酶提 蛋白法与其它三种提取方法差异极显著 即胰蛋白酶提蛋白法显著优于其它三种 提取方法 在现有条件下提出碱提蛋白法的主要 T 艺条件指标 以鲜虫为基质 在碱液浓度为1 5 碱提温度为8 0 抽提聍闻为6 0 r a i n 固液比为1 1 0 时 有最太得率 以干虫为基质 在碱液浓度为o 5 碱提温度为8 0 C 抽提时问 为9 0 m i n 固液比为l 1 0 时有最大得率 盐提蛋白法的主要工艺条件指标 咀 鲜虫为基质 盐渡藏度为1 B 盐提温度为2 0 抽提时间为l h 固液比为1 2 0 时有最大得率 以干虫为基质 盐液浓度为1 o 盐提温度为2 0 抽提时 间为3 h 圆液比为1 15 时有最大得率 胰蛋白酶法提蛋白的主要工艺奈件指 标 以鲜虫为基质 醇与虫重比为0 g 酶解温度为5 5 酶解时阃为3 h 霹 液比为l 2 5 时有最大得率 以干虫为基质 酶与虫重比为0 d 酶解温度为 5 5 酶解时目为6 h 固液比为1 2 0 时有最大得率 h i s I H c l 提蛋白法主要 工艺条件指标 以鲜虫为基质 p H 值为8 3 抽提温度为2 0 2 抽提时间为3 0 m i n 固液比为1 10 时有最大得率 以千虫为基质 p H 值为8 3 抽提温度为2 0 X 3 抽提时间为1 2 0 m i n 圈液比为1 1 0 时有最大得率 聚雨烯酰胺凝胶电泳分离 昆虫蛋白在提取缓冲液p H 值为8 2 4 分离胶浓度为1 2 Y 电压为1 0 0 1 3 0 V 时分 亘签堡些奎兰堡圭兰垒笙壅垦皇墨皇塑墨三兰塑堡堕堕垫 墨 离效果最佳 鸡蛋和黄褐油葫芦卵两种样品分离得到的蛋白质条带最多 鸡蛋可 见6 条 黄褐油葫芦5 条 其他样品中牛奶蛋白条带有2 条 猪肉有2 条 并且 猪肉中最清晰的条带与鸡蛋中的一条在胶板上位置相当 应为同一蛋白 黄褐油 葫芦肌肉蛋白条带为3 条 黄粉虫蛋白条带为4 条 关键词 资源昆虫蛋白质提取黄粉虫黄褐油葫芦 I I 吉林农业大学硬士学位论文昆虫蛋白提取工艺指标酶毙较谚觅 A b s t r a c t T h em a t e r i a l so fe x p e r i m e n t a t i o nw e r eT e n e b r i om o l i t o rL a n d T e l e o g r y l l u s d e m l i c t u sG o r o e h o v T m ss t u d y g o t a c r o s s f i l t e r i n gr e s e a r c ht h e b e s te x t r a c t m e t h o d sa n dp r i m a r yt e c h n i c sg u i d el i n eo f e v e r ym e t h o d sf r o mf r e s ha n dd r i e da n d w i p e do f f f a t w o r n i s a n dt h es e p a r a t e dt h ep r o t e i n so fi n s e c t sa n dc o m p a r e d 耐mt h e t r a d i t i o n a lp r o t e i n sf o o d s a n dc a w i eo u tt h a ta sr e s o u r c e si n s e c t sw h i c h v e r eT e n e b r i o m o l i t o rL a n dT e l e o g r y l l u sd e r e l i e l u sG o r o c h o v w h i c hw e l et h eb e s te x t r a c tp r o t e i n s m e t h o da n dt h ed i f f e r e n tc o n s t i t u t e so fp r o t e i n so fi n s e c t sa n dt r a d i t i o n a lf o o d s a n d p u tu pw i t he x a c ts c i e a c eb a s i sf o re f f e c t i v ee x p l o i t a t i o na n du t i l i z a t i o n T l l i S e x p e r i m e n ta d o p t e df o u rk i n d so f e x t r a c tp r o t e i n sm e t h o d sf r o mi n s e c t s t h e yW e r et h e e x t r a c tm e t h o do fa l k a l i t h ee x t r a c tm e t h o do fs a l t t h ee x t r a c tm e t h o do fp a n c r e a s p r o t e i n a s e t h ee x t r a c tm e t h o do fT d s H C I b u f f e rs o l u t i o n r e s p e c t i v e l y A m o n gt h e m e t h o d s i tW a st h ef i r s tb eu s e dt oe x t r a c tp r o t e i n so fi n s e c t sw i t h I r i s H C In 他 e x p e r i m e n to ft e c h n i c si n v o l v e dc o n c e n t r a t i o n t e m p e r a t u r e t i m e t h ev a l u eo fp H a n dt h er a t i oo fs o l i da n dh q u i d A c c o r d i n gt ot h es e p a r a t i o no fp m t e i n so fi n s e c t s u s e dP A G Ee l e e t r o p b o m s i s a n dt h ec o n d i t i o n s o fP A G Ee l e c t r o p h o r e s i sa n d c o n l r a s t e dt h ed i f f e r e n tb a n d i n g so fP A G Ee l e c t r o p h o r e s i so fi n s e c t sa n dt r a d i t i o n a l f o o d s n l cr e s u l t sw e r ei n d i c a t e dt h a tw h e ne x t r a c t e di n s e c t sp r o t e i n s u s i n g 也e 船s h w o r m se x c e lt h a au s i n gt h ei n s e c t st h a tw i p e d0 1 1 f 斑 E x t r a c t i n gp r o t e i nf r o m 丘e s h W O I I U S t h eb e s tW a St h em e t h o do f p a n c r e a sp r o t e i n a s o t h es e c o n dW a st h em e t h o do f a l k a l i t h e t h i r d W a S t h e m e t h o do f T f i s 挂C l a n d t h e w o r s t W a s t h e m e t h o do fs a l t I f e x t r a c t i n gp r o t e i nf r o md r i e da n dw i p e do f ff a tw o r m s t h es e q u e n c eo ft h eg a i n e d r a t i oo fp r o t e i nc o n s i s t e n t e dw i t ht h ef i e s hW O I R I S b u tt h em e t h o do fp a n c r e a s p r o t e i n a s e v e r ys i g a n i f l e a n t e d d i f f e r e n t w i t h t h e o t h e r s m e t h o d s 弧帕b e s tc o n d i t i o n o f m e t h o dw i t ha l k a l iW a St h mt h ec o n c e n t r a t i o nb e i n g1 5 t e m p e r a t u r eb e i n g8 0 C t i m eb e i n g6 0 r a i n a n dt h er a t i oo f s o l i da n dl i q u i dW a S1 1 0f o rt h e 丘 e s hw o H n s b u t f o rt h e 酬e dO n e St h ec o n c e n t r a t i o nb e i n g0 5 t e m p e r a t u r eb e i n g8 0 t i m eb e i n g 9 0 m i n a n dt h er a t i oo f s o l i da n dl i q u i dW a Sl 1 0 T h eb e s tc o n d i t i o no f m e t h o dw i t h s a l tw a st h a tt h ec o n c e n t r a t i o nb c m g1 O t e m p e r a t u r eb e i n g2 0 C t i m eb e i n gl h a n dt h er a t i oo fs o l i da n dl i q u i dW a Sl 2 0f o rt h ef l e s hW O n T l 8 b u tf o rt h ed r i e do n e s t h e c o n c e n l T a t i o n b e i n g1 0 t e m p e r a t u r e b e i n g2 0 C t i m e b e i n g3 h a n d t h er a t i oo f m 更签壅些查 竺主兰竺笙室 垦皇墨鱼墨璺三苎塑塑塑堡墼墨垄 s o l i da n dl i q u i dw a s1 1 5 T h eb e s tc o n d i t i o no f m e t h o dw i t hp a n c r e a sp m t e i n a s ew a s t h a tt h ec o n c e n t r a t i o nb e i n g0 8 t e m p e r a t u r eb e i n g5 5 C t i m e b e i n g3 h a n dt h e r a t i oo fs o l i da n d l i q u i dw a s1 2 5f o rt h e 舭s hw o r l n s b u tf o rt h ed r i e do n e st h er a t i o o fq u a l i t yb e i n gO 4 t e m p e r a t u r eb e i n g5 5 t i m eb e i n g6 h a n dt h er a t i oo fs o l i d a n dl i q u i dw a s1 2 0 T h eb e s tc o n d i t i o no f m e t h o dw j t l lT r i s H C lW a st h a tt h ev a l u eo f p I Ib e i n g8 3 t e m p e r a t m eb e i n g2 0 2 t i m eb e i n g3 0 m i n a n dt h er a t i oo fs o l i da n d l i q u i dW a s1 1 0f o rt h ef 诧s l lw o r m s b u tf o rt h ed r i e do n e st h ev a l u eo f q u a l i t y 碱n g 8 3 t e m p e r a t u r eb e i n g2 0 C t i m eb e i n g1 2 0 m i n a n dt h er a t i oo fs o l i da n dl i q u i dw a s 1 1 0 I nt h ee x t r a c tp r o t e i n sm e t h o d sf r o mi n s e c t s t h eg a i n e dr a t i oo fp r o t e i n so f m e t h o dw i t hp a n c r e a sp t o t e i n a s ew a st h eb e s t t h es e c o n db e i n gt h ee x t r a c tm e t h o d w i t ha l k a l i t h em e t h o dw i t hT r i s H C Ib e i n gt h e l 耐 a n dt h em e t h o dw i t hs a l tw a s t h ew o r s t T h eb e s tc o n d i t i o n so fP A G Ee l e c t r o p h o r e s i sw e I et h a tt h ep Hw 嬲8 2 4 a n dt h e c o n c e n t r a t i o no fs e p a r a t eg l u eW a s1 2 a n dt h ep r e s s u r ew a s1 0 0 1 3 0 V T h e m o s tp r o t e i n sb a n d i n g sw e r ec h i c ka n dT e l e o g r y l l u sd e r e l i c t u sG o m c h o v Se g g s t h e r e w e r e6a n d5r e s p e c t i v e l y w h i c hc o u l ds e ec l e a r l y O t h e r sp r o t e i n sb a n d i n g sm i l ka n d p o r kh a d2 t h em u s c l eo fT e l e o g r y l l u sd e r e l i c t u sG o r o c h o vh a d3 T e n e b r i om o l i t o rL h a d 4 K e yw o r d s r e s o u r c ei n s e c t e x t r a c tp r o t e i n s d e r e l i c t u sG o r o c h o v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 焉i 渗挝 签字日期 挪 年厂月加日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许 论文被查阅和借阅 本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位 论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 黍多i 蛩蒡乙 导师签 签字日期 c 耔 j 年 月如日签字日期 多1 研一年厂月纱日 学位论文作者毕业后去向 匆霞菇强零舀 工作单位 诗j 氢爰煽厮觉庄酗 欲溥尘学盘 电话 通讯地址 者若膏积压 诌酮圈西穆端 邮编 D9 彳 重型查竺堡主兰竺堕壅 垦皇墨鱼墨墨三苎塑堡箜生墼塑壅 1前言 2 l 世纪 人类面临着更为严峻的入口剧增 资源匮乏及环境污染的压力和 挑战 开辟新资源 走可持续发展道路是我国农业产业化发展的必由之路 昆虫 作为地球上最大的未被充分利用的资源宝库而倍受关注 昆虫蛋白质资源的开发 及其产业化 必将进入以高科技 高收益为特点的多层次 综合利用阶段 昆虫 富含蛋臼质 不饱和脂肪酸 微量元素 是入类的高级营养源 1 1 蛋白质资源短缺是当今世界惶危机之一 蛋自质是生命的构成物质 蛋白质资源不足是当今世界存在的四大危机之一 1 1 统计资料表明 全世界约有三分之二的人缺乏蛋白质 我国蛋白质消费水 平更低 只有发达国家的一半 并略低予第三氆界国家的平均水平 特别是在入 口急剧增长的趋势下 寻找蛋白质资源补充未来粮食的不足 为人类和现代畜牧 业发展提供充足的蛋白矮 已成为摆在我们蟊嘉蓍的一项迫切任务 1 1 2 昆虫蛋白质是2 1 世纪人类重要的蛋白源 随着科学技术的发展 人们越来越清楚地认识刭 昆虫是极好的蛋白质资源 昆虫是世界上种类最多且生物量巨大的生物类群 已知的种类超过1 0 0 万种 其 生物量超过陆地上所有动物 包括人类 其中可食用或有潜在营养价值的昆虫 达3 6 0 0 多种 且具有食物转换率高 繁殖速度快 蛋白质含量高等特点 有些 昆虫还含有特殊的有效成分 具有一定的保健功能 我国昆虫的种类约有1 5 万 种 估计可食用的昆虫也有i 0 0 0 多种 我国是世界上开发利用资源昆虫历史最 为悠久的国家 据营养学家分析 已知许多可食用昆虫的蛋白质含量很高 有的 甚至超过人们经常食用的鸡 鸭 鱼 猪 牛 羊等动物性食品 且昆虫纤维少 微量元素丰富 易于吸收 特别是人体需要的氨基酸含量最多 营养价值极高 所含脂肪多为软脂肪和不饱和月旨肪酸 消化性能皂好 在8 5 以上 开发潜力巨 大 1 3 高蛋白昆虫资源的开发与利用研究 壹苎室些查堂堕主兰垡丝室 墨皇墨鱼茎墨三苎塑堡塑些茎堑壅 2 0 世纪6 0 年代以来 R a m o sJ E 博士等 墨西哥 对食用昆虫营养成分 的理论研究 为昆虫蛋白资源的进一步开发利用提供了理论基础 德国目前对昆 虫蛋白提纯已投入工厂化生产 美国9 0 年代实现了食用昆虫的工厂化养殖 日 本应用昆虫蛋白生产氨基酸系列产品已获多项专利 我国8 0 年代开始这方 面研究 先后对家蝇 黄粉虫等饲用蛋白昆虫进行了人工养殖及应用技术的研究 并取得了一些成果 1 对食用昆虫的研究 开发了蚂蚁系列产品 蚕蛹 蚕蛾保 健品等 1 3 1 基础研究 1 3 1 1 昆虫体蛋白质含量及其质量评价 营养分析是确定昆虫资源开发价值的基础 随着人们营养观念的转变 各国 都开始研究昆虫的营养组成 尤其是对蛋白质和氨基酸的质量评价与成分分析研 究 对于蛋白质营养高低的评价 一方面是所含必需氨基酸的种类及含量 即必 需氨基酸的种类越多 含量越高 则蛋白质的营养价值也越高 一方面是蛋白质 的必需氨基酸数量相互之间的比例要适宜 与人体的需要相符合 1 国内外的 许多研究都表明 无论昆虫的虫态为卵 幼虫 蛹或成虫 体内粗蛋白含量大多 都在5 0 7 0 千重 远大于鸡 鱼 猪肉 鸡蛋 与牛肝相差无几o 据谢保令 1 9 9 1 测定的黄粉虫营养成分分析的结果 黄粉虫成虫 幼虫 及蛹的粗蛋白含量都较高 分别为6 3 7 4 5 0 9 8 5 6 9 7 据王达瑞 等 1 9 9 1 对家蝇幼虫 蝇蛆 营养素的分析报道 蝇蛆的营养成分全面 尤其是粗蛋白质 含量较高 无论是鲜蝇蛆 蛋白质含量为1 5 6 或干蝇蛆 蛋白质含量为 6 0 8 其粗蛋白含量都与鲜鱼 鱼粉及肉骨粉相近或略高 其脂肪及糖类等含 量均高于鱼粉 蝇蛆粉中氨基酸的含量均高于鱼粉 且其氨基酸总量是鱼粉的 1 8 倍 必需氨基酸总量是鱼粉的2 3 倍 据史树森 徐伟 等 2 0 0 5 研究黄 褐油葫芦虫体蛋白质鲜重含量在整个生育期平均为1 5 9 2 卵和9 龄雌虫蛋白 质含量最高 其虫体中包含1 8 种氨基酸 其中8 种人体必需氨基酸 除苏氨酸 和赖氨酸外 氨基酸分值均超过F A 0 1 H 0 需要量模式 能够满足人体需要 属优 质蛋白 另外 黄褐油葫芦蛋白质含量在若虫期与发育阶段呈显著正相关 1 8 种氨基酸除胱氨酸外 在若虫期 含量与发育阶段呈正相关 其中丙氨酸 缬氨 酸 蛋氨酸 酪氨酸 色氨酸相关性显著 蝗虫是一类平均蛋白质含量很高的昆 虫 有的高达7 7 干体 乔太生报道 中华稻蝗粗蛋白含量占干体的7 3 4 2 宣苎堡些查兰堡主兰竺笙塞 墨圭墨鱼墨塞三苎塑堑箜堕塾要塞 氨基酸含量齐全 必需氨基酸占总氨基酸含量的4 7 7 3 蚂蚁蛋白质含有2 8 种 游离氨基酸 包括人体必需的8 种主要氨基酸 及人体不能自身合成的7 种游离 氨基酸 从营养角度上讲 大多数昆虫可以同传统的食用蛋白源相媲美 据许士 国 等 2 0 0 0 对三种直翅目昆虫棉蝗 C h o n d r a c r i s r o s e 8 优雅蝈螽 6 a m p s o c l e i sE r a t Y o n s a 蟋蟀包括斗蟋属 V e l a r i i o t o r u s 和棺头蟋属 L o x o b l e m m u s 两种蟋蟀混合 其体内干物质以蛋白质为主 约占干物质总量 的三分之二 粗蛋白含量分别为6 5 8 7 1 3 和6 6 7 9 6 三种昆虫都含有1 8 种 氨基酸 其中包括7 种人体必需氨基酸 蚕蛹含有蛋白质高达6 8 3 蛋白质较 软 极易水解被人体消化吸收 而且含有人体所必需的1 8 种氨基酸 其含量均 高于大豆 且组分合理 昆虫含有的氨基酸 如赖氨酸 苏氨酸 缬氨酸 异 亮氨酸都大大超过联合国粮农组织规定的食品含量标准 其中聚蛋白可促进人体 新陈代谢 是强健体质的佳品 此外 柞蚕蛹也是一类较理想的蛋白质饲料资源 其蛋白质含量也比较高 达干体的5 2 1 4 蛋白质中必需氨基酸的含量较高 尤其是赖氨酸 色氨酸 亮氨酸的含量很丰富 其含量高于猪 牛 羊 牛奶等 食品 1 3 1 2 高蛋白昆虫的人工养殖技术研究 除传统的养蜂和养蚕早已形成产业化外 近来 黄粉虫和家蝇的人工养殖技 术己获得成功 可以初步进行工厂化生产 近2 0 年来 又发展了一些食药用昆 虫养殖业 如蚂蚁 地鳖虫 蟋蟀 蝼蛄等 这些昆虫的人工饲养都取得了较大 进展 1 家蝇 M u s c ad o m e s t i c aL 北京市营养源研究所的翟桂荣 黄自元 张乃仲等 华中农业大学的雷朝亮 鲁汉平 钟昌珍等 镇江市科委沈晓昆等都作了大量的研究工作 目前已基本具 备工厂化生产能力 2 黄粉虫 T e n e b r i om o l i t o rL 黄粉虫的饲养约有1 0 0 年的历史 近年来取得了很大进展 1 陈兆春 石淑 芬 陈彤 王克等都报道了黄粉虫饲养的最新技术 山东农业大学刘玉升等成功 地培育成了三个黄粉虫新品种G H 1 G H 一2 G H 一3 并根据该品种的生物学特性 及发育规律 创造了适宜的环境及设备条件 完成了工厂规模生产技术流程 吉林农业大学硕士学位论文 昆虫蛋白提取工艺指标的比较研究 1 3 2 开发与利用研究 1 3 2 1 食用昆虫 全世界已知可食用的昆虫达3 6 5 0 余种 有学名可查的1 5 0 0 种左右 我国记 载的可食用昆虫达1 7 0 余种 分属于蜉蝣目 蜻蜒目 直翅目 蜚蠊目 等翅目 半翅目 同翅目 广翅目 鞘翅目 双翅目 鳞翅目和膜翅目4 人类食用昆虫具有悠久的历史 据资料推断 从史前开始 墨西哥的土著人 就有食虫的习惯 在我国早在2 0 0 0 多年前的 周礼 天富 中就有食 虫氏 蚂 蚁 的记载 1 现代可食用昆虫的开发始于德国 由于第二次世界大战后的粮 食不足 德国研究人员试图用昆虫来生产食品 最近几十年来 通过国内外有关 学者的探索和研究 人类对食用昆虫的利用意义与过去相比有了更深刻和更广泛 的认识 特别是昆虫作为一类巨大的蛋白质资源 已经取得了许多专家和学者的 共识 并掀起了一股研究与开发昆虫蛋白质的热潮 从此 一门新兴的介于昆虫 学和营养学之间的边缘交叉学科 食用昆虫学 也就逐渐形成了 1 昆虫作为食品原料 传统的加工方法有烧 烤 油炸 腌制等 我国从汉代 开始就对蚂蚁进行了初步加工 当时人们把蚂蚁磨成粉 炼制成 金刚丸 用 来治疗筋骨软弱嘲 今天 昆虫蛋白系列食品己开始大规模工厂化生产 将可食 昆虫加工成饼干 罐头 蜜饯 面包 糖果 酒等食品和饮料 昆虫蛋白质提纯 已投入工厂生产 日本预测4 0 年后医用蛋白质等产品的市场规模将达到5 5 0 0 0 亿日元 其中用蚕蛹制取优质蛋白 生产氨基酸系列产品已获多项专利 德国的 昆虫蛋白提纯已投入小规模工厂化生产 美国 法国及澳大利亚等国家的昆虫加 工公司也在蓬勃发展n 中国开始重视昆虫食品的开发与研究是在二十世纪八十年代以后 到目前为 止 已用蚂蚁 蜂王浆 蜜蜂幼虫以及蜂花粉等开发出多种保健饮料和食品 昆 虫蛋白提纯是近十年发展起来的新工艺 由于昆虫体内蛋白质含量高 容易提出 高纯度的优质蛋白质 不仅扩大了在食品工业上的应用范围 可用作营养剂或强 化食品的添加剂 生产各类糕点 而且 可以作为医药工业的原料 用黄粉虫为 原料制作清蛋糕 酱油 调味料 氨基酸虫酒的工艺已有相应的报道 1 浙江 吉林等省 已研制出用蚕蛹生产营养酱油 营养豆腐 膨化果 味精等 华中农 业大学从事蝇蛆研究多年 以蝇蛆血淋巴为原料研制出了 力诺健之素 以及 以蝇蛆几丁糖为原料的 力诺活力素 4 燮些查兰堡主兰竺堡壅 垦皇墨鱼墨坚三苎塑堡塑些墼要窒 1 3 2 2 饲用昆虫 昆虫被用作饲料已有悠久的历史 我国早在二十世纪五十年代就有利用昆虫 喂养家禽的报道 上世纪7 0 年代后 各地开展了这方面大量的研究工作 取得 了较显著的成果 尤其是家蝇 黄粉虫等饲用价值较高的昆虫已具备初步工厂化 的生产能力 目前已被开发用作饲料的昆虫主要有 家蝇 黄粉虫 家蚕蛹 蝗 虫等 黄自占等 1 1 9 9 1 用于蛆粉代替秘鲁鱼粉所组成的饵料喂饲一龄草鱼 饲养 期 个月 蛆粉处理比鱼粉处理增重2 0 8 0 1 从上世纪7 0 年代末开始 我国不 少地区便利用鲜蛆或蛆粉饲喂蛋鸡 湖南农业大学的姚福根 甘肃饲料研究所的 楚焕彩 司信等用蛆粉代替等量鱼粉饲养蛋鸡 都取得了理想的结果 张宏 黄 自占等相继用鲜蛆养猪 效果明显 黄粉虫作为动物饲料历史悠久 近年来 除用作禽类饲料外 还用作特种 经济动物 蝎子 蛤蚧 牛蛙 鳖 观赏鱼及特种鸟类 的高级饲料 现已 有很多专业养殖户 仅在杭州市的花鸟市场上每年活虫销量就达l O 2 0 t 黄粉 虫的饲养效果可使动物生长增快 抗病力增强 繁殖量加大 存活率提高 与 蚯蚓 蝇蛆等饲料相比 具有明显的优势 用黄粉虫喂养的蛤蚧生长快 产卵 多 每只蛤蚧每月可增重1 7 1 8 8 9 用3 6 的鲜虫代替等量鱼粉喂养肉鸡 比用鱼粉喂养增重达1 3 饲料报酬率达2 3 陈家荣 1 1 9 8 9 报道 从1 9 7 4 年以来 他们就开始试用蚕蛹喂养畜禽 效 果显著 彭芳彬 用蚕蛹喂猪 每日平均增重2 3 6 缩短了肥期 提高了肥猪 出栏率 用蚕蛹养鸡效果也很理想 若基础饲料组体重增长为1 0 0 则添加蚕 蛹粉后鸡重增长6 6 而添加鱼粉只增重1 1 7 3 除以上几种昆虫外 已开始开发的饲料资源昆虫还有蝗虫 蟋蟀 蝼蛄 蛴螬 蚂蚁等 3 此外 何剑中等作了云南松毛虫蛹和蛾蛋白饲料价值的研究 林启训 吴珍泉对食粪天虻和甘薯天蛾作为动物性蛋白资源作了理论探讨 上 述试验和研究都证明 昆虫是一类优质动物蛋白饲料资源 具有诱人的应用前 景 1 4 昆虫蛋白质提取工艺的研究 研究昆虫蛋白质的提取与纯化技术 是进一步开发与利用昆虫蛋白源的前 提 从5 0 年代到7 0 年代 动物蛋白主要是以有机溶剂提纯 虽然产量较高 但 童苎壅些查兰堕主兰丝堡塞 垦圭墨鱼量墨三苎塑塑塑些茎堑塞 对含硫氨基酸破坏性大 灰分含最高 品质差 此后 碱提法为人们广泛采用 可是 据报道热碱提取使蛋白质变性 严重影响其品质 而低温提取则产量偏低 1a 昆虫蛋白质提取是8 0 年代迅速发展起来的一项新工艺 提纯的昆虫蛋白质 是食品和医药工业中的重要原料 在国外 昆虫蛋白主要以非溶解性提法提 炼 由于难于解决褪色 除臭等问题 加上纯化过程繁琐 而没有广泛应用于工 厂化生产 因此 目前许多学者仍致力于对昆虫蛋白质提取工艺的研究 供试昆 虫主要为黄粉虫和家蝇 而对于其他昆虫蛋白的提取鲜有报道 李广宏等 s T 1 9 9 6 以家蝇 M u s c ad o m e s t i c av i c i n aM a q u a r t 幼虫为材料 采取单一选 择试验和正交区组旋转组合设计相结合的方法 筛选出盐提一酸沉淀法为提取昆 虫蛋白质的一种较理想的方法 刘怀如等 3 2 0 0 3 对黄粉虫 T e n e b r i om o l i t o r L 采用碱法和酶法提取去脂虫渣中的蛋白质 得出以下结论 酶法提取出的蛋 白粉中氨基酸的含量均很高 碱法提取得到的蛋白粉得率低 冀宪领 盖英萍 以黄粉虫幼虫脱脂虫粉为原料 用碱提法和盐提法提取了黄粉虫幼虫蛋白质 测 试了两种提取方法的工艺条件 通过对蛋白质提取效率的比较 得出盐提法优于 碱提法 并对盐提法制得的蛋白质氨基酸组成进行了分析 可见 目前用于提取 昆虫蛋白质的方法主要有 碱提法 盐提法和酶提法 由于研究者所用的材料和 处理方法不同 其结论不尽相同 而由于对提取昆虫蛋白质各种方法尚无系统的 比较研究 因此 对于同一基质物究竟采用那一种方法更理想 尚不十分清楚 1 5 目的和意义 本研究的目的在于通过系统比较各种提取蛋白质方法的实际效果 选择一种 或几种高效的昆虫蛋白质提取方法 并对其提取工艺条件进行优化 最终获得最 优的提取方法和工艺条件 提高提取昆虫蛋白质的得率 质量和效率 同时对黄 粉虫和黄褐油葫芦蛋白质进行了分离 并与传统的食用蛋白源 如鸡蛋 牛奶和 猪肉等进行了对比 关于昆虫蛋白质的提取方法及工艺研究主要集中在黄粉虫与家蝇上 对黄褐 油葫芦蛋白质的提取方法在国内外尚未见报道 本试验以黄褐油葫芦为研究对 象 为开发蟋蟀蛋白质的研究提供科学依据 在提取方法方面 使用胰蛋白酶法 提取昆虫蛋白鲜有报道 而使用T r i s H C l 法提取蛋白质的研究尚无报道 以往昆 虫蛋白质与传统蛋白源的比较 主要集中在对蛋白质总含量的比较 以及氨基酸 组分中是否含有人体必需氨基酸等 本试验以聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离各种蛋 白源蛋白质 比较昆虫蛋白源与传统蛋白源所含蛋白质组分的差异 妻签查 业查兰堡主兰苎堡苎 垦皇墨鱼墨里三苎塑堡堕生墼塑塞 咀确在目前条件下提取昆虫蛋白质的最佳方法 提出优化的提取工艺条件 是有效开发昆虫蛋白质资源的基础和前提 我国作为缺乏蛋白质来源的国家 积 极开发利用昆虫蛋白质资源具有十分重要的现实意义 1 6 前景与展望 2 1 世纪随着人口的激增和人们生活水平的进一步提高 人们对优质高品位 动物蛋白质的需求量将越来越大 作为衡量人们膳食营养水平重要指标的动物蛋 白质的短缺 将成为人们生活水平提高的制约因素 而昆虫作为一类庞大的动物 蛋白质资源 它的开发与利用无疑将为人类解决蛋白质资源危机做出巨大贡献 昆虫蛋白质的开发与利用将成为2 1 世纪昆虫学研究开发利用的热点o o 科学 技术的不断进步将为昆虫蛋白质产业化进一步提供技术支撑 一些繁殖快 饲料 成本低 转换率高 人工生产投入少的可食用昆虫和饲用昆虫将率先解决人工养 殖技术问题 进行大规模工厂化生产 将促进相关昆虫产业的发展 可以预见 昆虫源新型蛋白质系列食品或动物蛋白饲料将在2 1 世纪的相关行业中独树一 帜 对一些重大害虫采取资源化宏观管理措施 如进行蛋白质资源开发 一方面 可阻补充食品行业和饲料行业蛋白质资源的不足 同时 可以降低其危害性 减 小用于防治的巨额费用 另一方面 可以避免因大量使用农药防治而带来的环境 污染 此外 家蝇幼虫 作为药用 明朝李时珍的 本草纲目 中就有记载 蛆 又称 五谷虫 罗仙子 水仙子 可治小儿甘热 为治疳疾之良药 众所 周知 家蝇从幼虫到成虫均生活在杂菌横生的环境力 在人类和动物间传播多种 疾病 而其自身却很少患病 即使在高密度人工饲养的条件下也不会发生大规模 传染病而死亡 因此 许多科学家认为 家蝇极可能具有比一般昆虫能有效地抵 御病原菌感染的独特的免疫防御机制 1 9 7 2 年 瑞典科学家B o m a nH G 首先发 现家蝇昆虫蛋白含有一类碱性多肽 抗菌肽 这种抗菌肽对于革兰阴性及阳性 细菌均有较强的杀灭作用 其效力要超过青霉素十几倍 美国和日本的科学家发 现 家蝇昆虫蛋白还会有一种对肿瘤细胞显示抑制作用的外源性凝集素 研究表 明 家蝇昆虫蛋白内含有极丰富的抗菌肽 外源性凝集素和免疫蛋白 随着对家 蝇昆虫蛋白的深入研究和基因工程的进一步发展 抗菌肽和外源性凝集素将成为 抗肿瘤药物研制的新方向 最近 英国皇家医学会己将从蝇蛆提取的抗生素列为 2 1 世纪抗癌首选药物 在我国 对家蝇昆虫蛋白的研究也正在积极开展 4 利用高新技术来生产高价值的昆虫蛋白质也将是2 1 世纪昆虫蛋白质开发的一个 7 吉林农业大学硕士学位论文 昆虫蛋白提取工艺指标的比较研究 重要领域 随着生物技术在昆虫领域中的深入研究 在昆虫细胞内和虫体内生产 各种有价值的蛋白质将成为可能 上世纪8 0 年代以来 以杆状病毒为载体在昆 虫细胞和虫体中表达外源基因的系统由于其有表达产量高 对外源基因容纳量 大 表达产物后加工过程比大肠杆菌表达系统完全 成本低廉等优势 因而很快 发展为生物工程中得以广泛应用的4 大表达系统之一 研究表明 通过携带外源 基因的重组病毒可以在昆虫细胞和虫体中生产各种有价值的蛋白质 如家蚕和野 蚕的丝腺能产生大量特异的蛋白质 目前已对有关基因结构 表达调控等进行了 较深入的研究 将来通过转基因途径 利用丝腺器官和有关丝腺蛋白基因启动子 来大量生产用于医药等方面的高价值的蛋白是完全有可能实现的 1 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 供试昆虫 供试昆虫由吉林农业大学农学院资源昆虫研究室提供的黄粉虫与黄褐油葫 芦实验种群 在常规条件下饲养并适时取样 2 1 2 脂肪抽提试剂材料与仪器设备 试剂 石油醚 沸点6 0 一9 0 仪器 索氏提取器 天玻 水浴锅 粗滤纸 2 1 3 蛋白质提取试剂材料与仪器设备 试剂 氢氧化钠 分析纯 氯化钠 分析纯 胰蛋白酶 化学纯 上沪试 剂 三羟甲基氨基甲烷 T r i s 上海惠世 蒸馏水 仪器 F S H 一2 型可调高速匀浆器 江苏荣华 P H S 一2 5 数字精密酸度计 上海 虹益 C e n t r i k o nT 一4 2 K 低温离心机 日本 万分之一电子天平 移液管 离心管 W M K 一0 2 型温度控制器 隔水式电热恒温培养箱 吉林农业大学硕士学位论文 昆虫蛋白提取工艺指标的比较研究 2 1 4 蛋白质含量测定试剂与仪器设备 2 1 4 1B r a d f o r d 检测法 试剂 9 5 7 醇 分析纯 8 5 磷酸 分析纯 牛血清白蛋白 分析纯 上 海惠世 考马斯亮蓝G 2 5 0 化学纯 上海沪试 仪器 U V 7 5 1 G D 一紫外光分光光度计 水晶比色杯 加样头和加样枪 移液管 小试管 E p p e n d o r f 管 试剂的配制 1 B r a d f o r d 储存液 取l O O m l9 5 乙醇与2 0 0 m l8 5 磷酸混合 再加入3 5 0 m gS e r v aG 蓝 在室 温下长期保持稳定 2 B r a d f o r d 工作液 取1 5 m l9 5 乙醇和3 0 m l8 5 磷酸加入4 2 5 m l 双蒸水和3 0 m lB r a d f o r d 贮存 液 充分混合保存于室温棕色瓶中 3 l m g m l 牛血清白蛋白 精确称量l O O m g 牛血清白蛋白溶于蒸馏水中 在1 0 0 M 容量瓶中定容 2 1 4 2 凯氏定氮法 试剂 3 0 过氧化氢 分析纯 硼酸 分析纯 氢氧化钠 分析纯 溴甲 酚绿 甲基红 4 4 学纯 9 5 乙醇 分析纯 盐酸 分析纯 四硼酸钠 分析 纯 硫酸铜 分析纯 硫酸钾 分析纯 浓硫酸 分析纯 蒸馏水 仪器 电子天平 凯氏烧瓶 曲颈漏斗 消煮架 凯氏蒸馏装置 电热炉 电热套 洗瓶 三角瓶 容量瓶 移液管 酸式滴定管 试剂的配制 1 硼酸指示剂 溶解2 0 9 硼酸于9 5 0 m l 的热蒸馏水中 冷却后 加入2 0 m l 的混合指示剂 充分混匀后 小心滴加氢氧化钠溶液 c N a O H 0 1 m o l L 直至溶液呈红紫色 p H 约4 5 稀释成1 L 2 混合指示剂 溶解0 0 9 9 9 的溴甲酚绿和0 0 6 6 9 甲基红于l O O m l 的乙醇 C C H C H 0 1 4 9 5 中 3 0 O l O O m o l L 盐酸的配制和标定 用吸量管取8 3 m l 的浓盐酸 加入1 L 的蒸馏水中 准确称取三份0 4 0 0 0 0 6 0 0 0 克四硼酸钠 倒入三个2 5 0 m l 的三角 直签壅些查兰塑主兰堡堡壅 垦皇墨鱼茎里三苎塑堡箜生塾竺壅 瓶中 再取一个对照空瓶 将四个三角瓶中各加入3 0 m l 蒸馏水 充分溶解后加 入2 滴硼酸指示剂 然后用已配制的0 1 m o l L 盐酸滴定空白对照与三个盛有四 硼酸钠的三角瓶 直到溶液变为酒红色为止 记录所用的盐酸的毫升数 用公式计算配制盐酸的实际浓度 N 2 w v v o o 1 9 0 7 N 盐酸的实际摩尔浓度 m o l L V 滴定的盐酸量 r n l V o 滴定空白对照的盐酸量 m l w 四硼酸钠的质量 g 4 粉末硫酸钾一硫酸铜混合物 K S 吼 C u S O 5 H 0 3 1 8 0 9 硫酸钾 2 0 9 硫酸铜 C u S 0 4 5 H O 充分研细混合物 5 3 0 氢氧化钠的配制 取1 8 0 9 氢氧化钠溶解于4 2 0 m i 的蒸馏水中 2 1 5 蛋白质分离试剂材料与仪器设备 试剂 丙烯酰胺 化学纯 上海惠世 双丙烯酰胺 化学纯 上海惠世 三羟甲基氨基甲烷 T r i s 化学纯 上海惠世 盐酸 分析纯 过硫酸胺 分 析纯 T E M E D 四甲基乙二胺 上沪试剂 甘氨酸 甘油 溴酚蓝 考马斯亮蓝 R 2 5 0 化学纯 甲醇 分析纯 冰醋酸 分析纯 仪器 D Y Y I I l 6 B 型温压稳流电泳仪 北京六一 S O N Y 一数码相机 日本 D Y C Z 3 5 型垂直式电泳槽 北京六一 微量注射器 微量进样器 2 0 m l l O O m l 北京 染色和脱色用的容器 烧杯 滴管 一次性塑胶手套 试剂的配制 1 工作液的配制 1 溶液A 丙烯酰胺储备液 l O O m l 3 0 丙烯酰胺 0 8 双丙烯酰胺 3 0 9 丙烯酰胺和0 8 9 双丙烯酰胺 加入蒸馏水至l O O m l 搅拌至完全溶解 用石蜡膜封口 以保持溶液状态 2 溶液B 4 分离缓冲液 l O O m l 5 m o l LT r i s H C I p H 8 8 1 8 2 9T r i s 溶于4 0 m l 蒸馏水中 加入盐酸至p H 8 8 加蒸馏水至l O O m l 3 溶液C 4 堆积胶缓冲液 l O O m l 0 5 m o l LT r i s H C I p H 6 8 主型曼 堕塑塑型苎笔 望兰 一 垦皇墨鱼墨里三茎塑量箜生茎要塞 6 O gT r i s 溶于4 0 m l 蒸馏水中 加入盐酸至p H 6 8 加蒸馏水至i 0 0 m l 4 1 0 的过硫酸胺 5 m l 0 5 9 过硫酸铵溶于5