第一章 生物产品分离技术研究的历史.doc

第一章 生物分离技术的研究历史11引言生化分离技术对生物技术对生物学的发展起着重要的作用，而近代生化分离技术与瑞典Uppsala密切相关。瑞典Uppsala大学在生化分离方法的研究最早起源于Svedberg。在20年代初，Svedberg在Uppsala大学物理化学系首先采用超高速离心技术，分离蛋白质等生物大分子。1924年，Svedberg发明了超高速离心机，并且首次从血液中分离出血红蛋白（Hb）1。1926年，Svedberg由于超高速离心机的发明及血红蛋白的发现获诺贝尔化学奖。1925年，23岁的Arne Tiselius大学毕业后，作了Svedberg的研究生。当时Svedberg认识到蛋白质的物理性质不但可以在离心场中观察到，而且有可能在电场中研究。因此他鼓励Tiselius从事移动界面电泳法（Moving boundary method）的研究。1930年Tiselius首先发明了一种U型管自由移动界面电泳装置，之后Tiselius对该装置进行了改进，如采用冷却系统消除热扩散。他的学生Philpot和Svensson发明了一种紫外光学系统，用于检测蛋白质，即现在常用的紫外检测器的雏形。1937年Tiselius推出了新的电泳装置2，并将有关结果投到几个生物化学杂志，但这几个生物化学刊物都没有刊登这篇文章，可能这篇文章涉及的都是物理仪器的内容，而生物的内容较少。但Tiselius采用新的移动界面电泳装置从血清蛋白粗品中分离出血清蛋白及三种球蛋白，它将这三种球蛋白命名为、球蛋白。1937年Uppsala大学因为Tiselius的工作专门成立了生物化学系，Tiselius成为生物化学系的第一位教授，但他的实验室仍主要在物理化学系，由于物理化学系拥有许多当时世界领先的仪器，如超高速离心机、电泳装置等。40年代后，Tiselius开始了色谱分离技术的研究。1956年，Tiselius首先发明了羟基磷灰石，系统研究了吸附色谱的规律，建立了至今仍在应用的三种色谱洗脱方式：洗脱、前沿及置换，Tiselius首先将梯度洗脱引入色谱。由于Tiselius在色谱及电泳方面的杰出贡献，1948年Tiselius获得诺贝尔化学奖2。50年代后，Uppsala大学生物化学系在新型生化分离技术研究上进入了一个黄金时代。1959年发明了凝胶过滤（Gel filtration），60年代发明了等电聚焦、凝胶电泳。70年代的金属亲和层析分离技术和毛细管电泳技术等。培养了一大批世界著名的教授，如凝胶过滤的发明人Jerker Porath，毛细管电泳的发明人Stellan Hjerten等。而且Tiselius的许多学生进入了工业界，参与了瑞典两大生物技术公司Pharmacia和LKB及美国的Bio-Rad公司的建设，如1950年Kirstie Granath在Pharamacia建立了物理化学实验室，1953年在电泳领域颇有建树的Svensson成为LKB的研究开发部主任；1954年Sephadex的发明人Per Flodin成为Pharmacia的葡聚糖实验室主任。1955年Bertil在Pharmacia建起了生物化学实验室。这些任命不但加强了工业界和Uppsala大学生物化学系的联系，而且加速了科研成果向企业界的转化，给企业带来了巨大的财富，如Pharmacia公司年销售额的三分之一（1983年）是从生化分离技术（介质）中获得的。LKB的主要产品如层析、电泳都来自Uppsala大学。美国Bio-Rad公司的层析介质Biogel A、Biogel P及毛细管电泳管也是来自Uppsala大学。世界范围内生化分离的层析介质（软介质）及电泳装置的技术主要来自Uppsala大学。因此60年代到80年代Uppsala大学生物化学系被国际学术界称为“Uppsala分离技术学院”。12 凝胶过滤的发现历史1.2.1 Dextran的发现1941年23岁的Ingelman从Uppsala大学毕业后，作了Tiselius的研究生。Tiselius让他接手一个瑞典制糖厂的项目，从甜菜糖中分离出果胶，以替代进口果胶。当时由于二战，果胶极为缺乏，Ingelman意外的发现其提取的果胶中存在另一种多糖葡聚糖（dextran）。为了提高dextran的成胶性，Ingelman采用一种双功能基团交联剂环氧氯代丙烷进行交联，得到了一种不溶于水，但在水中溶胀的凝胶。他将有关结果报告给制糖公司，但制糖公司对这种水不溶性凝胶并不感兴趣，因此Ingelman1946年放弃了这个成果的专利申请。但Ingelman发现这种凝胶能够渗透一些物质而排斥一些物质，有可能用于医药，因此Ingelman没有公开发表有关内容。1946年他进入Pharmacia后，继续dextran的研究。1947年Pharmacia推出了第一个基于dextran的浸剂溶液（商品名Macrodex）。1950年Pharmacia由Stockholm搬到了Uppsala，同时Ingelman被任命为dextran研究室主任，之后Pharmacia开发出许多dextran产品，成为世界上生产dextran的最大厂家3。1.2.2 凝胶过滤和Sephadex的发明50年代，Tiselius开始研究填充柱中的电泳。他的两个学生Per Flodin和Jerker Porath先后于1950年和1952年也加入了这个行列，研究用淀粉、纤维素等为填充物抑制电泳热扩散，并在制备填充柱电泳上取得了进展。1954年Flodin离开Tiselius实验室到Pharmacia任职，而Porath继续在生物化学系从事填充柱区带电泳的研究，但这两位朋友经常保持联系，讨论一些科研问题。当时Porath对纤维素粉的结果也不十分满意，由于其吸附作用较大。1956年秋天，Flodin建议Porach试一下交联dextran。Porath在实验中吃惊的发现大分子量的蛋白质反而比小分子量的蛋白移动的快。1957年Porath向Flodin报告了这一情况，并说交联dextran柱和几年前研究的淀粉柱具有类似的分子筛效应，但是物理性质要比淀粉好得多，而且孔径可以准确的控制。这两位科学家立刻意识到它们的发现就有重要的科学意义和潜在的应用价值。Ingelman知道这一消息后，立刻让Flodin专门制备凝胶，而Porath主要进行蛋白质和肽的分离实验，并且Pharmacia很快立项。经过几个月的实验，得到了令人满意的结果，开发了一种可以替代透析的色谱过滤技术。Pharmacia申请了两项专利，一项是凝胶制备，1958年3月申请，发明人为Flodin和Ingelman。另一项专利为凝胶过滤（gel filtration）方法，1958年4月申请，发明人为Flodin和Porath。申请专利后，由Pharmacia总经理Elis Goth和Tiselius教授提议，Pharmacia开始生产交联dextran，商品名为Sephadex，由Separation、Pharmacia和dextran三个字的字头组成。1959年Porath和Flodin在Nature上发表了著名的文章“Gel Filtration：A Method for Desalting and Group Separation”，第一次提出了凝胶过滤技术4。1959年，Pharmacia开始出售两种凝胶Sephadex G-25和Sephadex G-50。G为Gel的字头，数字表示胶的带水量（1克干胶所能带水的最大量乘以10）。1960年Pharmacia又开发出Sephadex G-75，1963年Sephadex G-100和Sephadex G-200问世，1965年高度交联的Sephadex G-10 和Sephadex G-15上市，而且Sephadex的衍生物如DEAESephadex也陆续问世，从而形成了Sephadex家族，Sephadex是目前生物分离中应用最广的层析介质之一。1.3.Agarose 的发现和凝胶电泳的诞生1961年美国的Polson首先将agar（琼脂）用于垂直柱电泳中，但由于agar有很多带电基团，对电泳产生干扰，导致重复性不好。60年代初Uppsala大学生物化学系的Stellan Hjerten开始研究agar。通过文献检索和实验他发现agar是由agarose（琼脂糖）和agaropectin（琼脂果胶）组成，agar中的带电基团是agaropectin引入的。其实这一结果早在1937年首先由日本学者Araki发现，Araki在一篇文章中阐述了agar是由两部分琼脂糖和琼脂果胶组成，但由于这篇文章发表在日文杂志上，因此很少有人知道。Hjerten从agar中分离出agarose，并且将agarose制成了凝胶球，成功的建立了agarose凝胶电泳5。同时Hjerten意识到新做成的agarose凝胶很有可能用于凝胶过滤。经过实验Hjerten发现agarose凝胶完全可以用于层析介质，因而发明了agarose凝胶。Hjerten首先和LKB商量申请专利，但LKB由于经费原因放弃了专利权。而后Hjerten又建议Pharmacia公司申请专利，但Pharmacia当时对agarose凝胶不感兴趣，Hjerten只好将这个研究结果公开。Hjerten将agarose凝胶珠用于电泳，取得了很好的分离效果。之后Hjerten又研究了聚丙烯酰胺凝胶，发现这种凝胶用于电泳，可以分离许多蛋白质，从而奠定了凝胶电泳的基础。美国的Bio-Rad公司根据这一结果制备凝胶，商品名为Biogel A。之后Pharmacia意识到这种凝胶的重要性，开始生产这种凝胶，商品名为Sepharose，取Separation，Pharmacia和agarose的字头和字尾。但普通的agarose凝胶稳定性较差容易压缩。70年代初Porath和Jan Christer Janson等人对agarose凝胶进行交联，生产了今天常用的交联Sepharose CL，将agarose交联技术申请了专利，从此交联型Sepharose成为Pharmacia的主要产品。70年代后Sepharose的衍生物如离子交换树脂问世，80年代Pharmacia开发了高度交联的Fast Flow Sepharose介质和Superose，从而奠定了Sepharose在生化分离中的盟主地位。14 毛细管电泳的诞生 管式电泳的一个重要问题是热效应问题，但采用细管可以降低热波效应。Hjerten于1967年首先提出了毛细管区带电泳（CZE），他用一个内径3mm涂有甲基纤维素的石英管进行电泳，这是最早的毛细管电泳，但操作麻烦。1970年Everaerts 等人报告其在毛细管等速电泳（CITP）系统上得到的CZE结果，但结果还是不尽人意。1974年Virtanen提出应采用更细的毛细管提高分离效率，同时可减少热效应。1979年Mikkers用200 um内径的毛细管进行试验，获得等板高度小于10um高效，这是CZE研究历史上的一次重大突破。1981年Jorgenson 和Lukacs使用75um石英管毛细管进行CZE试验，由于热效应小，他大胆地采用了高电压（30kV），他惊人地发现每米可获得4万块理论板，从此高效毛细管电泳正式诞生。1983年Hjerten又提出了毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦，不仅可以大幅度提高效率，而且可以实现自动化和定性和定量测定。1986年Lauer第一次报道了蛋白质在CZE中可以获得每米10万块理论板的极高效率，这一结果大大地激发了有关CZ研究，同时许多分析仪器厂也加入了毛细管电泳的竞争。1988年美国BioRad公司推出了国际上第一个毛细管电泳仪。目前毛细管电泳已成为分析上十分有效的一种分析方法，每年全世界发表的有关毛细管电泳的论文超过2500多篇，还有十多个厂家生产毛细管电泳仪器。15 亲和层析的发现历史151 染料亲和层析的发现 染料亲和层析由于价格低廉、应用方便而成为目前亲和层析中应用最多的之一。染料亲和层析的发现应该归功于东德莱比锡大学的Kopperschlager 教授。瑞典Pharmacia Fine Chemicals 公司为便于测定观看凝胶介质的死时间，以推广凝胶过滤，将ICI公司生产的活性蓝染料Cibacron Blue F3GA接到水溶性的高分子葡聚糖上，作为凝胶过滤的分子量标记物。1968年Kopperschlager教授在一次偶然的凝胶过滤试验中，发现丙酮酸激酶（Pyivate kinase）和蓝染料一起在死时间流出，似呼该激酶的分子量比预计大的多，他将该酵母激酶单独走凝胶过滤柱，发现该酵母激酶的流出时间却在死时间之后，如何解释这个现象，他立即想到可能是该激酶和蓝染料活化的葡聚糖结合，实际上在凝胶柱上二者作为一个结合物一起通过柱子，因此在死时间流出。在发现了这个规律后，Kopperschlager立即联想到如果将蓝染料固定在agarose介质上，便可以由于吸附纯化激酶，从而产生一种新的层析技术。很快Kopperschlager教授用试验证实了这个想法，从而诞生了染料亲和层析技术。之后许多研究者研究了不同染料和蛋白质结合的情况，打开了染料亲和层析的应用局面。152 固定化金属离子亲和层析（1） 科学家必须具备创造性思维及敏锐的观察力。Dextran的发现及Sephadex、Sepharose的发明和应用，最先的发现都有偶然，但Ingelman、Porath和Hjerten都具有敏锐的观察力，抓住了机遇，而且不墨守陈规，大胆创新，使偶然的发现变为成果。（2） 将理论和实验有机的结合起来。Sephadex的发明与具体的电泳设备、层析装备及检测仪器密切相关的，Sephadex的商品化很大程度上归功于整套层析设备的实用性，同时也建立了凝胶色谱理论，凝胶色谱理论对Sephadex的普及又起了推动作用。（3） 和工业界的密切关系。Sephadex很快推向市场，获得成功，说明不但科学家和企业界的工程师之间的默契配合，而且企业的决策者和科研机构的领导者之间也应达成共识和相互支持，才能及时的将科研成果转化为生产力。致谢瑞典Uppsala大学Jerker Porath教授、Stellan Hjerten教授、Jan Christer Janson教授为本文作者提供了大量的素材，在此深表感谢。参考文献（1） Svedberg T. and Rinde H. J. Amer. Chem. Soc. 1924,46:2677-2693（2） Tiselius A. Trans. Farady. Soc. 1937,33:524-531（3） Jan Christer Janson Chromatographia,1987,vol.23,No.s:361-369（4） Porath J.& Flodin P. Nature,1959,183:1