中医中药新型分析技术在中药领域中的研究与应用课件

新型分析技术在中药领域中的研究与应用 第二军医大学药学院柴逸峰2008 4 一 中药分析现状 中药成分复杂 活性成分较多 未知成分更多 药效成分不够明确中药采用单个或几个成分作为质控指标 难与中药多成分 多靶点 整体作用的中医药理论相吻合中药分析采用的技术方法相对滞后缺乏可靠有效的分析方法是制约中药发展的瓶颈之一 二 中药分析需解决的关键问题 标准 如何科学有效地对中药及中药复方进行质量控制与评价 方法 如何采用现代分析技术对中药化学物质组信息进行获取与评价 一 中药质量控制与评价研究 1 中药复方质量控制的关键点 以中医复方配伍理论和方证相结合为指导方 证 效 化学组分群的相关性分析对中药多途径的病症靶点 建立或选取相应的证症相关的药理毒理体内外模型通过对中药化学组分群 体内代谢过程与生物效应的相关性分析 确定评价指标 2 研究思路 3 中药复方质量控制体系 在中医方证相关理论指导下 以方 证 效 化学组分群为核心 通过复方中药指纹谱及生物效应谱的建立 探讨生物体内相关化学组分群与生物效应的相关性 建立符合中药复方多成分 多靶点 整体作用特点的质量控制体系 二 现代分析技术对中药化学物质组信息的获取与评价研究 1 研究基础 中药中多数化学成分已被分离提取 为中药化学指纹谱及生物代谢指纹谱研究奠定了基础 现代分析技术的发展 特别是各种质谱联用技术的发展 为中药复杂系统分析提供了可能 2 现代分析联用技术 含量测定 HPLC DAD HPLC MS HPLC MS MS GC MS成分鉴别 HPLC DAD HPLC TOF MS GC MS HPLC MS MS HPLC QIT MS LC MS联用技术体系 单重四级杆质谱 选择离子监测 含量测定三重四极杆 选择离子监测 二级碎片裂解 结构分析及含量测定离子阱质谱 多级碎片裂解 结构分析高分辨飞行时间质谱 精确质量测定和可能的分子式匹配 液相色谱 液质联用 已知成分蜂 化学对照品验证 准确分子量 TOF MS 化学结构 QIT MS 质量控制 HPLC DAD HPLC MS HPLC MS MS 化学成分数据库 化学指纹谱 指标性成分的含量测定 未知成分峰 化合成分鉴别 中药提取液 中药成分分析流程 3 中药数据信息获取 建立中药信息数据库 积累分析先验信息 不分离 的数学分析手段进行重叠色谱峰的解析 色谱信息采集的通用性和一致性研究 硬件接口和软件数据模型转移智能化识别系统的建立 建立符合不同仪器的相应函数 指导数据模型转移 提高数据模型的通用性 4 信息提取与评价 数据特征信息提取 化学计量学降维方法提取特征信息 降低色谱数据维度 多维数据融合 对不同来源的多维数据进行数据融合 弥补单一分析模式的不足 中药模式识别 单方药材和复方中药方 证 效相关性分析 研究化学成分或有效物质与动物体内内源代谢信息 生物效应谱之间可能存在的内在联系 寻求建立相应的数学模型 寻找药效化学物质群 三 研究示例 一 实验仪器 AgilentHPLC1100 1200 HPLC DADAgilentSeriesHPLC MSAgilent6210TOF MSFinniganAdvantageQIT MS 二 丹参 丹参是临床上应用最普遍的中药之一 具有活血化瘀 凉血消肿 清心除烦之功效 其化学成分主要包括水溶性酚酸类和脂溶性二萜醌类成分 两类成分分别具有不同的药理活性 1 丹参药材样品溶液的制备 精密称取丹参药材粉末1g 过60目筛 置50mL锥形瓶中 加25mL70 的甲醇超声提取30min 制得丹参药材样品溶液 2 液相色谱条件 色谱柱 ZorbaxXDB C18柱 3 0 100mm 3 5 m 柱温 30 检测波长 280nm流速 0 4mL min流动相 0 4 的甲酸 A 和乙腈 B 梯度 0 15min 5to30 B 15 20min 30to60 B 20 30min 60to85 B进样量2 L 丹参药材样品溶液的HPLC DAD图 3 TOF MS质谱条件 正离子模式 ESI 0 18min毛细管电压 4000V电喷雾压力 40psig干燥气流速 9L min干燥气温度 350 碎片电压 70eV负离子模式 ESI 18 30min毛细管电压 3500V电喷雾压力 30psig干燥气流速 9L min干燥气温度 350 碎片电压 70eV ProtocatechuicacidProtocatechualdehyde CaffeicacidRosmerinicacid SalvianolicacidBClyptotanshinon Tanshinone Tanshinone A 丹参药材样品溶液的HPLC DAD图 丹参药材的HPLC DAD HPLC ESI TOF MS图谱 4 TOF MS用于中药化学成分鉴别优势 利用HPLC ESI TOF MS技术可迅速得到各化学成分的精确分子量 通过与自建丹参中化学成分分子式数据库进行比对 可鉴别出丹参中各化学成分从TOF MS的原理上分析 对于同分异构体TOF MS无法区分 但是对于那些具有不同化学结构且精确分子量具有微小差别的化合物 TOF MS比起一般的离子阱质谱可以更快速简便地进行区分 TrijuganoneB No 30 和1 2 didehydromiltirone No 36 分子量均为280trijuganoneB C18H16O3 280 10991 2 didehydromiltirone C19H20O2 280 1463正离子模式下 281 1178和281 1542HPLC ESI TOF MS下其准分子离子质量数计算偏差 3ppmNo 30 trijuganoneBNo 36 1 2 didehydromiltirone 5 QIT MS质谱条件 离子喷雾电压 4 5kV气帘电压 50arbitraryunits辅助气压力 10units毛细管温度 350 毛细管温度 10V漂移管电压 30V离子扫描范围 100 900m z碰撞能量 20 50 6 离子化形式 负离子模式 M H 2M H 正离子模式 M H M Na 2M Na 测定误差 5ppm 7 HPLC DAD ESI QIT MS对丹参中同分异构体进行区分 Tanshinone A Cryptotanshinone TanshinoneI salvianolicacidB rosmarimicacid Procatechualdehyde Caffeicacid Procatechuicacid Danshensu 丹参中酚酸类成分的多级质谱裂解规律分析 迷迭香酸是咖啡酸和丹参素的二聚体 丹酚酸B是咖啡酸和丹参素的四聚体 多级裂解中容易产生失去m z198 丹参素 和180 咖啡酸 的中性分子 其中去丹参素的离子碎片比去咖啡酸的离子碎片丰度大分子结构中存在羧基 容易产生 M H 44 的碎片离子 丢失一分子的CO2得来 分子结构中存在羰基 容易失去一分子CO 产生 M H 28 的碎片离子 酚酸类成分的碎片裂解形式 M H 198 Danshensu M H 180 Caffeicacid M H 44 CO2二萜醌类成分的碎片裂解形式 M H 18 H2O M H 28 CO M H 15 CH3 SalvianolicacidBfragmentationpathways caffeicacid 180 M H m z717 a m z339 c Danshensu 198 m z321 c Danshensu 198 C2H2O 42 m z279 d 28 CO m z251 e m z519 b 丹酚酸B的裂解途径 TanshitoneIIA CH3 CH3 CH2 CH2 CO CO m z277 b M H m z295 a H2O CH3 CH3 m z262 m z249 c m z221 d m z206 e m z191 f m z234 m z193 TanshitoneIIA的裂解途径 SalvianolicH Lithospermicacid No 10andNo 13peak m z537 1033Molecularformula C27H22O12 41 M 44 H M 44 198 H M 198 H M 198 28 H 二 狼毒 狼毒具有抗菌 抗病毒作用 特别是具有抗爱滋病毒作用 还有显著的抗肿瘤作用 瑞香狼毒根中含有黄酮类 香豆素类 苯丙烯酚类 木脂素类和二萜类等化学成分大戟科植物狼毒大戟和月腺大戟的根 二者并称为白狼毒 白狼毒中主要含有二萜类和乙酰间苯基三酚类等化学成分 1 狼毒样品溶液的制备 瑞香狼毒药材的提取条件为 取狼毒药材粉末0 5g 用甲醇20mL超声提取30min 取上清过滤 取续滤液得样品溶液 大戟科狼毒药材的提取条件为 取药材粉末1g 用70 乙醇10mL超声提取30min 取上清液过滤 取续滤液即得样品溶液 2 瑞香狼毒液相色谱条件 色谱柱 AgilentZorbaxXDB C18 3 0mm 50mm 1 8 m 柱温 20 检测波长 210nm流速 0 4mL min 1流动相 乙腈 水 梯度洗脱 3 TOF MS质谱条件 正离子模式 ESI 毛细管电压4000V 雾化气压力40psi 干燥气流速10L min 干燥气温度350 碎片电压90eV 负离子模式 ESI 毛细管电压3500V 雾化气压力30psi 干燥气流速8L min 1 干燥气温度350 碎片电压90eV 质量数扫描范围50 2000m z 1 4 3 D glucopyranosyloxy 1 E propenyl 2 6 dimethoxyphenyl 6 O D glucopyranosyl D glucopyranoside2 syringinoside cis isomerofsyringinosid 1 3 di O D glucopyranoside3 O D xylopyranosyl 1 6 D glucopyranosyl 7 hydroxycoumarin 瑞香狼毒甲醇提取样品正离子模式质谱总离子流图 瑞香狼毒甲醇提取样品负离子模式质谱总离子流图 11 C20H28O4可能为月腺大戟甲素12 C21H30O4可能为狼毒大戟甲素的同系物16 C21H30O4可能为狼毒大戟甲素的同系物20 C21H30O3可能为严大戟内酯A的同系物21 C20H28O2可能为严大戟内酯A的脱水物22 可能为严大戟内酯A的同系物 狼毒大戟提取样品ESI正离子模式质谱总离子流图 月腺大戟提取样品ESI正离子模式质谱总离子流图 12 C20H28O3可能为enti 11b hydroxyabieta 8 14 13 15 dien 16 12b olide17和18 C20H28O2可能为严大戟内酯A的脱水物 狼毒大戟提取样品MMI正离子模式质谱总离子流图 4 单重四极杆质谱应用于三种狼毒药材的鉴定 质谱条件 采用ESI源狼毒大戟及月腺大戟药材提取样品采用正离子模式 毛细管电压4000V 雾化气压力40psi 干燥气流速8L min 1 干燥气温度350 碎片电压70eV瑞香狼毒药材提取样品采用负离子模式 毛细管电压3500V 雾化气压力40psi 干燥气流速8L min 1 干燥气温度350 碎片电压70eV质量数扫描范围100 1000m z 54 三种狼毒提取样品的紫外色谱图A 瑞香狼毒提取物B 狼毒大戟提取物C 月腺大戟提取物 55 瑞香狼毒提取样品ESI负离子模式质谱总离子流图 狼毒大戟提取样品ESI正离子模式质谱总离子流图 月腺大戟提取样品ESI正离子模式质谱总离子流图 四 干姜 干姜是一种常用中药材 可治疗胃肠道紊乱 风寒 发炎 头痛 也用作止吐药 化学成分主要包括二芳基庚酸类和姜酚类物质 两类成分具有广泛的生物活性 药理活性 低毒性 1 干姜药材样品溶液的制备 精密称取干姜药材粉末1g 过40目筛 加25mL甲醇超声提取30min 过滤 取续滤液即得干姜样品溶液 2 液相色谱条件 色谱柱 AgilentEclipseXDB C18column 4 6 150mm 5 m 柱温 25 检测波长 280nm 370nm流速 1 0mL min流动相 水和乙腈梯度洗脱进样量 10 L 3 TOF MS质谱条件 正离子模式 ESI 毛细管电压 4000V雾化气压力 40psig干燥气流速 9L min干燥气温度 350 碎片电压 110eV负离子模式 ESI 毛细管电压 3500V雾化气压力 40psig干燥气流速 9L min干燥气温度 350 碎片电压 90eV 干姜ESI TOF MS正负离子模式总离子流色谱图 干姜在280nm和370nm处的HPLC DAD色谱图 相近分子量化合物ESI TOF MS图谱 ESI TOF MS图谱和同位素分布丰度图谱 相同元素组成物质在RP HPLC具有不同的保留时间 五 五味子 五味子为木兰科植物 有收敛固涩 益气生津与补肾宁心之效 现代研究证明 五味子生物活性成分主要是木脂素类成分 具有抗肝脏损伤 抗氧化等作用 1 五味子药材样品溶液的制备 精密称取五味子药材粉末1g 置250mL锥形瓶中 加甲醇100mL 称定重量 超声处理30min 放至室温 用甲醇补足减足减失的重量 摇匀 经微孔滤膜滤过 取续滤液即得丹参药材样品溶液 2 液相色谱条件 色谱柱 ZorbaxSB C18 3 0 100mm 3