生化实验知识点整理

百分吸光系数：指在一定波长下，吸光物质的溶液浓度为1g/100ml，光程为1cm时的吸光度，单位是ml/(gcm)。标准曲线：指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线。层析：指利用各组分物理性质的不同，随流动相通过固定相时分离速度不同将多组分混合物进行分离及测定的方法。层析法：混合物中各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。分离开的色素形成不同的色带而易于区分，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。 重组子：两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。重组子另一定义是指， 含有重组DNA分子的转化细胞电泳：带电粒子在直流电场中向着 所带电性相反的电极移动的现象。电渗：电动现象之一，指在电场作用下液体(通常是水)相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象。等电点：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。（pH大于等电点时蛋白质带正电，小于带负电）分配系数(Kd)：物质在两种不相混的溶剂中平衡时的浓度比。反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能是衡量溶质分子被阻滞程度的一个特征性常数分光光度法：根据物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法。是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。分子筛：狭义上讲分子筛是结晶太的硅酸盐或硅铝酸盐，由硅氧四面体通过氧桥键相连而成，广义上讲，结构中有规整而均匀的孔道，孔径为分子大小的数量级，它只允许直径比孔径小的分子进入，因此能将混合物中的分子按大小加以筛分 GOD法测定血糖：葡萄糖氧化酶（GOD）利用空气和水催化葡萄糖分子中的醛基氧化，生成葡萄糖糖酸和过氧化氢；过氧化氢经过氧化物氧化酶（POD）氧化成水和氧；氧将4-氨基安替吡啉和酚氧化成红色的醌化合物，醌和葡萄糖成正比。将醌与标准液比色，算出血糖的含量。感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。聚丙烯酰胺凝胶浓度（T）：每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr,a）和交联剂（Bis,b）总克数称为凝胶浓度，用T表示聚丙烯酰胺凝胶交联度（C）：凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C表示竞争性抑制：抑制剂的结构域底物结构相似或部分相似，可与底物共同竞争与酶的活性中心结合而抑制酶的活性。这种抑制使得Km增大，而Vmax不变。碱裂解法：是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。交联度：用C%表示，表示交联剂克数占凝胶总克数的百分数。交联度过高不仅凝胶变脆缺乏弹性且透明度降低交联度过低凝胶聚合不良呈糊状。拷贝数：就是指某基因（可以是质粒）在某一生物的基因组中的个数.空白管：即管内溶液用与样本相同的一切试剂而不含被测定的物质的试管,用以抵消或减少实验误差Lambert-Beer定律：是光吸收的基本定律，是描述物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度和厚度间的关系的定律，公式为A=Ecl，A为吸光度，E是吸光系数，c为浓度，l为厚度。摩尔消光系数/摩尔吸光系数：指一定波长时，溶液的浓度为1mol/L，光程为1cm时的吸光度值，用表示，单位是L/(molcm)。米氏常数（Km）：米氏常数，是酶的一个特征常数大小反映了酶与底物亲和力的强弱。米-曼氏方程：定量地描述底物浓度与反应速率的关系。（S：底物浓度 V：不同S时的反应初速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数(Michaelis constant) ）酶促反应动力学：研究酶促反应速率以及各种因素对酶促反应速率影响机制的影响的科学。酶单位：在最适反应条件下1小时完全消化1ugDNA的酶量为1个单位凝胶层析：是指混合物随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时,混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术内水体积（Vi）：层析柱中溶胀凝胶颗粒内部所含水相的总体积ml,也称内水体积，常用Vi表示逆转录：以RNA为模板，由逆转录酶催化4种dNTP聚合，产生DNA的过程，又称为RNA指导的DNA合成。迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，即载流子在电场作用下运动速度的快慢的量度，运动得越快，迁移率越大；运动得慢，迁移率小。琼脂糖凝胶电泳：是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖链依分子内与分子间氢键及它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔性凝胶。双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应双倒数作图法：一个酶促反应速度的倒数（1/v）对底物浓度的倒数（1/s）的作图。X和y轴上的截距分别代表米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）的倒数。外水体积（Vo）：层析柱床中溶胀凝胶颗粒间隙中液体所占的体积，即空隙的总体积，也称外水体积，常用Vo表示洗脱体积（Ve）：洗脱时间是指从加样开始到检测器检测出峰所经过的时间。在这期间内流出的洗脱液体积称为洗脱体积，常用Ve表示。限制性内切酶：一类具有严格识别位点，并在识别位点内或者附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶。血糖：即血液中所含的糖,通常是葡萄糖,机体能源之一。主要来源是食物中的淀粉和糖类，正常值为3.896.10mmol/L(70110mg/dl)印记术：将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印记术，已广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测。转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 质粒DNA：质粒为环形闭合的双股DNA，存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必需的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。绪论简述分光光度法原理。（5分）分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为I/I0。根据朗伯(Lambert)-比尔(Beer)定律，吸光度与溶液的浓度成正比，与光程成正比：A=KLC，C为该物质浓度，K为吸光系数，L为光程。简述分光光度法的波长选择的原则。（5分）一般是选择待测物质最大吸收峰的波长,但在实际测验中应该全面考虑应使被测溶液有适当的光密度.应使干扰影响降低至最低限度应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线实验一、蛋白质定量分析技术简述标准曲线的作用及绘制要点。（5分）作用：标准曲线又称校正曲线或工作曲线，它是比色分析法中不可缺少的步骤。从浓度-光密度直线的直线特性，可以判断所采用方法的呈色反应是否符合Lambert-Beer定律。做多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作、仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。作法: 标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。绘制要点：用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=1:1)或长方形(长：宽=3：2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。绘制标准曲线时，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此坐标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的直线。若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。双缩脲测定蛋白质浓度原理：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生 紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。方法：标准曲线法优点：操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小；缺点：灵敏度较差，特异性不高。-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。注意事项：双缩脲法测定蛋白质范围为1-10mg。BCA法测定蛋白质浓度原理：二甲酸喹啉（BCA）与硫酸铜等试剂组成的试剂，混合在一起后颜色为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下,BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原成Cu+,一个Cu+螯合两个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿变成紫色复合物，在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。优缺点:1.操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的lowry改良法快4倍且更加方便。2.准确灵敏，试剂稳定性好，bca试剂的蛋白质测定范围是20200ug/ml，微量bca测定范围在0.510ug/ml。3.经济实用，除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量。4.抗试剂干扰能力强，但仍受一些物质，试剂的干扰。方法:标准曲线法注意事项:实验操作的一般注意事项。紫外分光光度法测定蛋白质浓度法原理：蛋白质分子中含有具有共轭双键的罗酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测量的依据。但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必须要有待测蛋白质的标准纯品作比较，或且已经知道其消光系数作为参考。优缺点：1.操作简便，快速，样品经稀释后，倒入比色杯即可测定2.样品不缺失，测定后可以回收，多用于纯化蛋白质的微量测定3.主要缺点是精确度差，由于其他物质在同一紫外区又吸收以及不同蛋白质中芳香族氨基酸的含量变动过大所造成的。方法：标准曲线法计算：直接根据标准曲线与待测液的光密度值或从标准曲线，求的样本蛋白质.利用经验公式直接计算样本蛋白质含量吸取血清样本0.1mL置于50mL容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即500倍稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得吸光度，按下列公式计算：OD280/OD2601.5，用L-B定律计算：样本蛋白质含量（mg/ml）=OD280/KL=(OD280/6.31)10g/L本实验样品：牛血清白蛋白 百分吸光系数=6.3100mL/(cm.g) K:克分子消光系数实验二、酶动力学分析技术如何利用双倒数作图法求Km值？（4分）双倒数方程为1/V=Km/Vmax1/S+1/Vmax根据此方程,以1/V为纵坐标,1/S为横坐标,作图可得一直线.途中直线在1/V轴上的截距为1/Vmax,斜率为Km/Vmax.在1/S轴上的截距为-1/Km.因此根据直线在纵轴和横轴上的截距可求出Km二实验碱性磷酸酶Km值的测定：1操作过程的注意事项和某些步骤的意义:注意事项：1底物浓度和酶浓度都对酶促反应速度产生巨大影响，故实验成功与否，在很大程度上取决于各种试剂吸取量的准确性。2加入试剂以及酶后的保温时间必须非常准确。步骤的意义：1加入酶液立即计时是为了保证酶促反应时间准确。2保温结束，各管立即加入碱性溶液是为了终止酶促反应同时为下一步反应提供碱性环境。2米氏常数的测定原理：在酶促反应中，当反应体系的温度、PH及酶浓度恒定时，反应初速度随底物浓度s的增加而增加，最后达到极限，此速度称为最大反应速度Vmax。 Michaelis和Menten根据反应速度和底物浓度的这中关系推导出如下方程： V=Vmaxs/Km+S称米-曼氏方程，又称米氏方程，Km为米氏常数。根据上式，当V=Vmax/2时，Km=s.即Km为反应速度等于最大反应速度的一半时的底物浓度，Km是酶的特征常数，测定Km值是研究酶的特性的重要方法之一。3底物浓度曲线（双矩形曲线）的作图方法及利用图解求得Km和Vmax：由米氏方程（反应速率与底物浓度关系的数学方程式）V=VmaxS/(Km+S)S：底物浓度V：不同S时的反应速率Vmax：最大反应速率Km：米氏常数可得，在酶促反应中，当反应体系的温度、pH及酶浓度恒定时，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。以S对A作图，当S趋近于无限时，V趋近于Vmax，根据图估计Vmax，取Vmax/2，所对应S即为Km。4双倒数曲线的作图方法及利用图解求得Km和Vmax：米氏方程的的双曲线倒数方程：根据此方程：以1/v为纵坐标，以1/s为横坐标，作图可得一直线。图中直线在1/v轴上的截距为1/,斜率为/。在1/s轴上的截距为-1/。因此根据直线在纵轴和横轴上的截距可以求出和。三实验抑制剂型别的判定：1操作过程的注意事项和某些步骤的意义:注意事项：实验过程中，反应时间和试剂添加量要求精确实验步骤意义：添加1ml碱液，1ml4-氨基安替吡啉，2-铁氰化钾的意义:底物被酶水解后产生游离酚和磷酸盐，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物，根据红色的深浅就可测定酚的含量，从而计算出酶的活性大小。2碱性磷酸酶活性的测定和注意事项1原理：酶活性可以用在一定条件下所催化的化学反应速度来表示。测定酶活力，实际上是测定酶促反应的速度。反应速度一般以在一定条件下单位时间底物的消耗量或产物的生成量来表示。 碱性磷酸酶（AKP）活性用磷酸苯二钠法测定，即以磷酸苯二钠为底物。AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物。根据红色的深浅可测出酚的含量，进而算出相应的酶活性 (V)。再根据LineweaverBurk法作图，计算其Km值。酶促反应速率计算酶促反应速度以每15分钟所产生酚的微克数(g 15min)来表示。根据酚标准曲线查出各管的酚含量，即各管在不同底物浓度下的反应速度。本实验不制作酚标准曲线，而以1S对1A作图，因各管吸光度与其酚含量成正比，故可用吸光度代表酶促反应速度。2操作步骤底物浓度对酶促反应速度的影响 1)取试管8支，按下表操作(应特别注意准确吸取底物溶液及酶液)：底物浓度对酶促反应速度的影响 加入酶液立即计时，混匀后置37水浴准确保温15min。2)保温结束，各管立即加入碱性溶液1ml以终止反应。3)各管中分别加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5铁氰化钾2ml，混匀，放置l0min，以第8管调零点，于510nm波长处比色，测定各管吸光度。3注意事项(1) 该实验的成功与否，在很大程度上取决于各种试剂(特别是底物溶液和酶液)吸液量的准确性。(2) 加入酶液立即计时，混匀后置37水浴准确保温15min。 精确到秒3可逆抑制剂类型中抑制剂、底物、酶三者的相互关系及动力学特征(1)竞争性抑制酶不能同时和底物、抑制剂结合，既不能形成EIS，其动力学特征是：米氏常数的表观值Km增加，酶的最大反应速度Vm不变。(2)非竞争性抑制抑制剂、底物都能同时和酶形成EIS，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特征是： Vm降低，Km不变。(3)反竞争性抑制抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶形成EIS，其动力学特征是：Km和Vm都降低。竞争性抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂 Km增加，Vmax不变 Vm降低，Km不变 Km、Vm都降低4碱性磷酸酶抑制剂型别的判定方法选取KH2PO4作为碱性磷酸酶的抑制物。1、取试管8支，按下表操作(应特别注意准确吸取底物溶液、抑制剂及酶液)：加入酶液立即计时，混匀后置37水浴准确保温15min。2、保温结束，各管立即加入碱性溶液1ml以终止反应。3、各管中分别加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5铁氰化钾2ml，混匀，放置l0min，以第8管调零点，于510nm波长处比色，测定各管吸光度。 1/S 1/A 4、作图：借用米氏常数测定中的1/S-1/A标准曲线图，并与其在同一张坐标纸上画出1/S-1/A曲线。通过两条曲线的比较，根据直线在纵轴和横轴上的交点位置并计算其Km值，与未加抑制时的Km比较，判断属于何种类型。实验三、蛋白质的分离纯化鉴定试述从兔子肝脏中分离DNA的原理。（5分）在稀氯化钠（0.14mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。制成肝匀浆后，用0.14molL氯化钠溶液抽提，可将两种核蛋白分离，在分离过程中加入少量柠檬酸钠，可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用。SDS能使脱氧核糖核蛋白产生解聚作用，在含有脱氧核糖核蛋白的溶液中加入SDS，DNA即与蛋白质分离开，用氯仿将蛋白质沉淀除去，而DNA溶解于水相，最后用冷乙醇将DNA析出，而获得纯化的DNA。按分离机理简述层析分类吸附层析法分配层析离子交换层析凝胶层析法亲和层析疏水层析、聚焦层析、金属螯合层析等简述影响蛋白质电泳的因素。（5分）1电泳介质的pH值：溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢2.缓冲液的离子强度：溶液的离子强度是指溶液中各离子的摩尔浓度与离子价数平方的积的总和的1/2.带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比3电场强度：电场强度是指每厘米的电位梯度.电场强度对电泳速度起着正比作用，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快4电渗现象：在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗.在有载体的电泳中，影响电泳移动的一个重要因素是电渗。最常遇到的情况是-球蛋白，由原点向负极移动，这就是电渗作用所引起的倒移现象简述SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。（4分）简述聚丙烯酰胺凝胶电泳高分辨的原理。（5分）凝胶系统中存在三种效应：浓缩效应：由于电泳速度：Cl蛋白质氨基酸，蛋白质离子夹在中间，被浓缩成一薄层电荷效应：由于各蛋白质分子的PI不同，所带电荷不同，其迁移率也不同，各种蛋白质按迁移率的快慢顺序而分离分子筛效应：分子量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此将不同蛋白质分子分离开来LDH同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳中，分离胶混合液至少应包括哪些主要成份?其各自作用是什么?（5分）A液：分离胶缓冲液pH8.9B液：分离胶单体交联剂H2O1TEMED溶液：加速凝胶1过硫酸铵溶液：提供自由基简述等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶平板电泳测定蛋白质等电点的原理。（4分） 简述不同PH条件下，蛋白质分子解离及在电场中泳动的状态。（5分）实验四、物质代谢及调节研究实验五、质粒DNA的提取和鉴定简述在核酸分离实验中，0.14molL NaCl、5%SDS、氯仿、异戊醇、95%冷乙醇的主要作用。（5分）氯化钠溶液分离两种核糖核蛋白柠檬酸钠抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解SDS(十二烷基硫酸钠)能使脱氧核糖核蛋白产生解聚作用氯仿将蛋白质沉淀除去氯仿中加入少量异戊醇能减少操作过程泡沫的产生，并有助于分相冷乙醇将DNA析出。作用：1 溶液中的Tris-Cl溶液用于控制pH，EDTA是二价金属离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，50mmol/L葡萄糖用于提高溶液的粘度，防止后续步骤中DNA的断裂.2 溶液作用:SDS：破膜作用，变性蛋白质。 NaOH：破膜作用，变性基因组DNA3 溶液的作用：中和溶液，复性质粒DNA1) 溶液中含有乙酸钾和乙酸。2) 当溶液加入后，体系中的十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成不溶于水的十二烷基硫酸钾而沉淀。这使得与十二烷基硫酸钠结合的溶液中绝大多数蛋白质也发生沉淀。同时，由于大肠埃希菌的基因组DNA很长，长长的DNA易和蛋白质缠在一起而被十二烷基硫酸钾共沉淀。3) 溶液中的乙酸可中和NaOH,防止长时间的碱性条件打断DNA。4) 离心使被PDS共沉淀的绝大部分蛋白质以及缠在一起的基因组DNA因其密度较大而沉在离心管底部实现分离.取上清液，含有质粒DNA还有少量不能完全沉淀的蛋白质，于小离心管为纯化质粒DNA做准备. 4 加入饱和酚:溶液并不能完全沉淀蛋白质，苯酚是极强的蛋白质变性剂，可使溶液中的蛋白质完!全!沉淀。5 加入后离心溶液分成三层:上层为水相，有水和质粒DNA，以及微溶于水的苯酚；中层:苯酚；下层:沉淀的蛋白质6 酚可微溶于水，而溶解在水里的痕量酚即可抑制后续的酶切反应，所以在饱和酚沉淀蛋白以后，还需氯仿萃取水相中残留的酚。7 加无水乙醇的作用是脱水，因为乙醇和水以任意比例互溶，能将与DNA结合的水脱出，便于后面的沉淀物的干燥。8 TE为Tris-HCl和EDTA的混合液，EDTA可以螯合金属离子和DNase，Tris-HCl可以维持一定的pH，以稳定DNA结构，将质粒保存于TE中可以比在ddH2O中药稳定得多，保存更长时间。实验六、基因组DNA的提取和纯化原理：基因组DNA的提取和纯化原理：细胞内存在脱氧核糖核酸以及核糖核酸。他们分别会与脱氧核糖核蛋白以及核糖核蛋白结合而存在。前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中。提取DNA则需要经过将细胞裂解，分离核蛋白与DNA以及蛋白分解，DNA的提纯纯化等步骤。SDS温和裂解细胞并使得DNA与组蛋白分离。因为需要纯化DNA，故需要再加入RNase溶解RNA避免对结果造成影响。之后加入的蛋白酶K分解蛋白质，然后通过饱和酚以及酚氯仿进行第一次的提纯。之后用无水乙醇进行洗涤以及70%乙醇提纯。用TE缓冲液溶解DNA得到需要的DNA进行电泳。实验七、质粒DNA的转化、重组子的筛选、凝胶中DNA的回收简述凝胶层析的原理。（5分）凝胶层析利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是多孔网状结构物质，分子量小的物质能进入其内部，流下时路程较长，而分子量大的物质被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质通过层析柱的快慢不同而分离。过程 ：先制备感受态细胞转化克隆筛选具体原理：（一）载体：环状、具有自主DNA复制起始位点和可选择标记（如耐抗生素）的质粒。受体细胞：一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株（二）转化的方法1化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞2电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞（三）克隆的筛选：1原理：主要用不同抗生素基因筛选。如：氨苄青霉素amp、卡那霉素、氯霉素、四环素tet、链霉素2方法：将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞实验八、RNA的提取和RTPCR1.RNA的提取RNA提取过程的5个关键点：1.样品细胞或组织的有效破碎；2、有效地使核蛋白复合体变形；3、对内源RNA酶的有效抑制；（RNA酶性质稳定，不易变性，自然界中存在广泛，故做实验时需带手套操作）4、有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效去除。RNA提取的实验原理：Trizol试剂：异硫氰酸胍+苯酚（直接从细胞或组织中提取总RNA）异硫氰酸胍：在破碎和溶解细胞时能保持RNA 的完整性、裂解细胞并释放出RNA酸性条件下（苯酚）：使DNA与蛋白质进入有机相（之后可用氯仿萃取），而RNA留在水相（可通过异丙醇沉淀）2.逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）原理：RT-PCR是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术。首先在逆转录酶的作用下，以RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩整合成目的片段。作为模板RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。选择引物适用于缺点备注随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA，适用于所有RNA的逆转录反应rRNA的干扰用于单一模板的RT-PCR反应Oligo(dT)引物适用于具有PolyA尾巴的RNA（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴）mRNA 5端的合成对RNA样品要求较高基因特异性引物（GSP）适用于目的序列已知的情况cDNA的通用性，低丰度mRNA的逆转录检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。PCR技术:概念：是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性步骤：1.变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解螺旋解离形成单链DNA 2.退火：当温度突然降低，由于模板分子结构较引物要复杂得多，且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA,使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。3.延伸：在DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，5-3的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板；数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制。用紫外分光光度法测定牛血清白蛋白含量时，准确吸取牛血清0.1ml，加生理盐水9.9ml。稀释成待测样本，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值，A2800.454，A260=0.250,求牛血清白蛋白浓度（g/L）。已知牛血清白蛋白百分吸光系数6.3（100ml/(gcm)）。（4分）小于1.5 浓度=1.45OD280-0.74OD260 ，结果乘100大于1.5 浓度=OD280/K x L=（OD280/6.3 x 1）x 10 g/L，结果乘100在凝交通透层析（葡聚糖G50）中，蓝葡聚糖2000洗脱体积为8.6 ml，细胞色素C的洗脱体积为13.2 ml，DNFP甘氨酸的洗脱体积为21.6 ml,试计算该层析柱的内、外水体积及细胞色素C的分配系数。（5分）内水体积Vi=细胞色素C的洗脱体积13.2 ml外水体积Vo=蓝葡聚糖2000洗脱体积8.6 ml洗脱体积Ve= DNFP甘氨酸的洗脱体积21.6 ml分配系数Kd=(Ve-Vo)/Vi3(1)采用两种方法对待测-球蛋白溶液进行蛋白质定量分析。BCA法：标准管为50ml牛血清白蛋白（1.8mg/ml）50ml水2ml BCA工作液，A=0.250测定管为100ml-球蛋白溶液2ml BCA工作液，A0.300紫外分光光度法：标准管为2ml牛血清白蛋白（1.8mg/ml）2ml生理盐水，A0.300 测定管为2ml-球蛋白溶液2ml生理盐水，A0.450 分别计算两种方法测得的-球蛋白溶液的浓度。（3分） (2)这两种蛋白质定量方法在对同一管样品定量时，结果有很大的差别。判断哪一种定量方法的实验结果更加准确，说明判断依据。（2分）BCA：1.操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的lowry法快4倍且更加方便2.准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是 20-200ug/ml，微量BCA测定范围在0.5-10ug/ml 3.经济实用，除试管外，测定可在微板孔中进行，大大节约样品和试剂用量 4.抗试剂干扰能力比较强，但仍会受到一些物质如巯基试剂和去垢剂的干扰紫外分光光度法：1.操作简单，快速，