中心体Centrin蛋白在单环刺螠精子分化及早期发育过程中的表达研究.pdf

1 中心体中心体 Centrin 蛋白在单环刺螠精子分化及早期发育 过程中的表达研究 蛋白在单环刺螠精子分化及早期发育 过程中的表达研究 唐永政 烟台大学海洋学院 山东烟台 264005 E mail haoxiaodonglaile 摘摘 要 要 我们用抗 Centrin 多克隆抗体检测单环刺螠 Urechis unicinctus Von Drasche 精子 分化过程中 Centrin 的表达 结果显示在单环刺螠中从精细胞到精子的分化过程中都有表达 结果还显示在精子分化过程中 Centrin 的着色点由精细胞的一对逐渐变为精子细胞中的一 个 说明在精子分化和变态过程中 Centrin 分布的减少与远端中心粒的退化相伴随的 我 们用间接免疫荧光还检测了单环刺螠担轮幼虫分散的单细胞的 Centrin 表达 结果显示 除 在中心体中有定位外 在纤毛基体中有 Centrin 定位 我们还用 RT PCR 方法检测了 Centrin 同源基因在单环刺螠精子分化过程和早期胚胎发育过程的表达 结果显示 在单环刺螠精子 发生过程中的精细胞 精子团 精子中都有表达 而在成体的体壁组织 消化道组织 体腔 球中则没有表达 在未受精卵中没有表达 而在受精后释放极体的受精卵和经 A23187 孤雌 激活的卵中则有表达 在单环刺螠的早期发育过程 二细胞胚胎 多细胞胚胎 原肠胚 早期担轮幼虫 中都有表达 我们推测 Centrin 在单环刺螠精子发生过程中减数分裂或精 子细胞变态分化过程中发挥作用 在单环刺螠早期胚胎发育中 Centrin 可能与受精后中心 体的重建及担轮幼虫的纤毛形成有关 关键词 关键词 Centrin 单环刺螠 精子分化 早期胚胎发育 1 引言引言 Centrin 是一种在中心体和有丝分裂纺锤体两极的构成中普遍存在的蛋白 脊椎动物 Centrin 的 cDNA 序列显示它是一个高度保守的蛋白 是钙粘蛋白超家族的 EF hand 的成员 Centrin 最初是从绿藻 Tetraselmis striata 中鉴定的 1 分子量为 20KD 含有酸性等电点 它 是钙结合蛋白家族成员 含有四个 EF hand 结构域 helix loop helix 每个结构域均可结 合一个钙离子 同时在其序列中还有 PKA 和 P34CDC2的磷酸化位点 后来在酵母 2 高等植 物 3 无脊椎动物 4 哺乳动物 5 8 中均克隆出 Centrin 的同源基因 它们分别定位在中心粒 基体 中心体 有丝分裂纺锤体极部 分析酵母和衣藻的 Centrin 突变体和实验研究表明在 微管分裂和细胞周期中中心体的复制中 Centrin 是必不可少的 有关 centrin 蛋白在生殖细胞中的表达情况 2000 年 Manandhar G 和 Schatten G 研究了 恒河猴精子发生过程中的 gamma tublin Centrin 及中心体的变化 9 发现恒河猴精细胞中具 有明显的正常中心体 包含含 gamma tubulin 和 centrin 的一对中心粒 成熟的精子不含任 何可见的gamma tubulin 精子发生过程中与远端中心粒相连的 centrin 有一半左右消失了 残余的部分与中心粒微管紧密相连 成熟的精子含有高度退化的远端中心粒 这与 Manandhar G 等人对实验鼠的研究结果不同 10 用 centrin 抗体 他们发现实验鼠精细胞有 两个中心粒 在长形精子中 centrin 定位在颈部的中心粒上 而微管发生的核周部位没有抗 体 centrin 的定位 附睾中的成熟精子没有 centrin 标记 在成熟时 鼠精子丢失了近端和远 端中心粒 孙晓东等人研究了 centrin 家族基因在大鼠睾丸中的表达特征 11 结果显示 Centrin1 的表达具有睾丸组织和生精细胞特异性 它在减数分裂开始后转录 其 mRNA 水 平在圆形精子中达到最高 Centrin2 和 Centrin3 在睾丸精原细胞中高表达 进入减数分裂后 其 mRNA 水平迅速降低 相似的的结果也来自小鼠 Hart 等人曾报道 Centrin1 基因在 14 天小鼠的睾丸中开始表达 随后其表达水平也升高 而 Centrin2 的 mRNA 水平在这一过程 2 中下降 生精细胞发育为精母细胞后 中心体主要参与减数分裂以及组织鞭毛抽丝的产生 因此推测 Centrin1 可能与此阶段中心体的特定功能密切相关 如参与减数分裂纺锤体的形成 和在精子细胞变态分化阶段完成鞭毛轴丝的组装等 最近 Hart PE 等人研究了一种水生蕨类 Marsilea vestita 的精子发生过程 能游动的水生 蕨类 Marsilea vestita 的雄性配子是一个螺旋形的细胞 具有复杂的微管细胞动力学结构和大 约 140 根纤毛 这种生物的精子发生是一个快速的过程 20 C 下只需大约 11 小时 包含从 生毛体从头合成基体 他们发现 Centrin mRNA 贮存在小孢子中 Centrin mRNA 的表达是 精子发生的快速分化过程中的限制步骤 Centrin 是该种水生蕨类游动精子运动结构的形成 所必需的成分 12 15 基于目前无脊椎动物 centrin 的认识缺乏 本研究采用免疫荧光和 RT PCR 技术研究了 centrin 在单环刺螠精子分化过程的表达和早期胚胎发育过程中 centrin 的表达 探讨 centrin 在单环刺螠精子发生分化中的作用 及早期胚胎发育中的作用 2 材料和方法材料和方法 2 1 材料材料 繁育期的单环刺螠于 4 5 月采自山东烟台沿岸潮下带 在实验室条件下 置于 17 C 海 水中做短期饲养 可存活 7 10 天 不必给饲 2 2 方法方法 2 2 1 单环刺螠精子发育不同阶段的细胞的获得单环刺螠精子发育不同阶段的细胞的获得 取四月上中旬生殖细胞发育旺盛时期的动物 干放 5 分钟令其排干直肠中的海水 纵向 剖开动物体壁 释放体腔液 取体腔液镜检分辨雌雄及生殖细胞发育情况 取雄性体腔液于 试管中 4 C 自然沉降 30min 取不同层次细胞于 Eppendorf 管中 再于 4 C 沉降 20 分钟 可获得较纯的各发育时期的雄性生殖细胞 2 2 2 单环刺螠卵母细胞和精子的获得及体外受精单环刺螠卵母细胞和精子的获得及体外受精 选取体外观察肾管内含丰富的动物 解剖 取出肾管 观察动物性别 若为雌性 其肾 管内充满卵母细胞而呈黄色 若为雄性 其肾管内充满精子而呈乳白色 分别取雌雄的肾管 放于盛有 PH8 5 的天然海水的烧杯中 精卵分别自然从肾管中挤出 取适量精子滴入盛有卵 母细胞的海水的烧杯中 轻轻混匀 16 C 镜检受精情况 取 90 受精率以上的受精卵 提取蛋白和 mRNA 2 2 3 单环刺螠卵母细胞的孤雌激活单环刺螠卵母细胞的孤雌激活 将 A23187 用二甲基亚砜 DMSO 溶解成 3mmol L 的贮存液 20 保存 用终浓度 30umol L 的 A23187 激活卵母细胞 用相应浓度的 DMSO 作对照 120min 提取试验组和 对照组卵母细胞总 RNA 2 2 4 单环刺螠担轮幼虫单个细胞的获得单环刺螠担轮幼虫单个细胞的获得 取单环刺螠担轮幼虫于试管中 1000rpm 离心 5min 去上清 加入 2 3 倍体积的胰酶消 化液 37 消化 10 15min 用巴士德吸管吹打使担轮幼虫细胞分散 用 400 目筛绢过滤 滤 过物即为担轮幼虫的单细胞 1000rpm 离心 5min 收集细胞 PBS 洗一次 用 Cytospin 离心 涂片 1000rpm 5min 3 2 2 5 TriZol 提取细胞总提取细胞总 RNA 取适量 20 40ul 精母细胞 精子团 精子 卵细胞 受精后释放极体的细胞 二细胞 胚胎 32 64 细胞胚胎 原肠胚 担轮幼虫 分别 1000rpm 离心 5min 去上清 加入 1mlTriZol 冰上放置 10min 充分溶解细胞 加入 0 2 mL 氯仿 用手剧烈震荡 30 秒 冰上放置 15min 4 14000rpm 20min 离心 吸上清 约 0 5mL 至新离心管 加入 0 5mL 异丙醇混匀 20 放置 30 60min 14000rpm 4 20min 离心 沉淀用 1ml 100 乙醇洗一次 14000rpm 4 5min 离心 沉淀用 1ml 75 乙醇洗一次 14000rpm 4 5min 弃上清 沉淀在超净台中干燥 10min 左右至沉淀变为透明 加入 20 l 高压 DEPC 水溶解 55 60 10min DU640 紫外比色测 O D260 280 计算总 RNA 浓度 80 冻存用于以后实验 2 2 6 细胞间接免疫荧光 细胞间接免疫荧光 IIF 实验 实验 用 Cytospin 离心涂片 1000rpm 5min 用 0 5 TritonX 100 PEM 处理 2min 4 多聚甲 醛 PEM 4 多聚甲醛 80mM hepes 1Mm EDTA 1mM MgCl2 室温固定 15min PEM 洗 3 10min 或甲醇 丙酮 1 1 20 固定 10 分钟 PBS 洗 3 10min 加入 PBST 0 05 Tween 20 稀释的一抗 鼠抗 tubulin 1 50 稀释 抗中心体人自身免疫血清 1 100 稀释 兔抗 centrin 1 100 稀释 在 37 温育 1hr PBST 洗 3 10min 加入二抗 FITC 标记的抗 鼠 IgG 抗体 1 50 稀释 FITC 标记的抗人 IgG 抗体 1 200 稀释 FITC 标记的抗兔 IgG 抗 体 1 50 稀释 在 37 避光温育 1hr PBST 避光下洗 3 10min 蒸馏水洗一次 避光凉干 用甘油稀释的防淬剂封片 Olympus 荧光显微镜下检查 Confocal 下取像 2 2 7 RT PCR 实验前电泳检测所提 RNA 的质量 选取质量好的样品 作为 RT PCR 的模板 HsCEN1 保守序列的下游特异性引物法逆转录得 cDNA 反应体系为 25ul 1 RT buffer 1mM dNTPs 5Mm DTT Antisense Primer 50ng rRNAsin 10U AMV 10U 1ug 总 RNA 42 反应 60min 上 游 引 物5 GCGAATTCTGCCGTTAGGACCAC 3 下 游 引 物 5 GAGGATCCAATGCTTCCCGAACT 3 取逆转录产物 2 5ul 为模板进行 PCR 反应体系 为 25ul 1 PCR buffer 0 2mmol LdNTPs 2mmol L MgCL2 上下游引物各 50ng 1Utaq 酶 反应 条件为 94 变性 30s 58 复性 45s 72 延伸 30s 扩增 40 个循环 2 琼脂糖凝胶电泳检测结果 另外 以 HsCEN2 和 HsCEN3 的特异性引物如上法进行 RT PCR HsCEN2 的特异性引 物为 上游 5 CTXAGXGAAAAAGAATGAGC 3 下游 5 GTTACATGTGCTTGCAGTAG 3 HsCEN3 特异性引物为 上游 5 ATGAGTTTAGCTCTGAGAAGTGA 3 下游 5 TAAATGTCACCAGTCATAATAGC 3 3 实验结果实验结果 3 1 雄性单环刺螠体腔液中精子变态分化不同阶段细胞的兔抗雄性单环刺螠体腔液中精子变态分化不同阶段细胞的兔抗 Centrin 抗体的染 色 抗体的染 色 用抗 centrin 抗体免疫荧光检测雄性体腔液中不同发育时期的生殖细胞的 centrin 表达 结果 显示 如图 1 2 3 在早期精子细胞中 centrin 染色为明显的两个点 图 1 2 随着生殖 细胞的发育 到精子簇及肾管中的精子时 则只能见一个点 图 3 A B 精子簇时 着色点的 排列有一定的方向性 可能是由于精子簇中精子细胞的尾部都朝向外部的缘故 图 3A 在中期精子细胞中 还发现了在胞质中也有 centrin 分布 图 2A 在晚期精子细胞中 可 4 见两个染色点中的一个减弱了 图 2B 说明在单环刺螠的精子变态分化过程中 从早期 精子细胞到精子都有 centrin 表达 只是随着分化的进行表达量下降 图 1 早期精细胞抗 centrin 抗体间接免疫荧光和 PI 染色 可见细胞基本都显示成对的两个点 FITC 标记的 二抗 PI 染核 Confocal 取像 Photoshop6 0 处理 图 2 中晚期精子细胞的抗 centrin 抗体染色 A 图显示中期精子细胞仍然可见两个染色基本相当的点 箭头所示 同时胞质中也有分布 PI 染核 B 图显示晚期精子细胞中两个点中的一个已经减弱 箭头所示 PI 染核 图 3 精子簇及精子抗 centrin 抗体间接免疫荧光 A 图为精子簇的抗 centrin 抗体染色 显示只可见一个着色点 细胞团中 centrin 着色点的排列有一定的方向 性 PI 染核 B 图为精子的抗 centrin 抗体染色 PI 染核 5 3 2 精子精子 tublin 单染及单染及 tublin 与与 centrin 双染双染 取肾管中的精子 用鼠抗 tublin 单抗间接免疫荧光观察精子鞭毛 PI 染核 可见精子 很长的鞭毛和很小的核 图 4 A B 用鼠抗 tublin 单抗和兔抗 centrin 多抗间接免疫荧光 观察精子鞭毛与 centrin 的关系 PI 染核 可见 精子鞭毛是从 centrin 分布的位置即精子颈 部发出 图 4 C 图 4 精子的 tublin 间接免疫荧光染色图 A B 图为以抗 tublin 抗体为一抗 FITC 标记的二抗 显示精子鞭毛 PI 染核 C 图为抗 tublin 抗体为一抗 罗丹明标记的二抗和以抗 centrin 抗体为一抗 FITC 标记的二抗对精子进行双染 显示 tublin 与 centrin 的关系 PI 染核 3 3 抗 抗 Centrin 抗体间接免疫荧光检测抗体间接免疫荧光检测 Centrin 在担轮幼虫细胞中的表达在担轮幼虫细胞中的表达 对单环刺螠担轮幼虫分散开的细胞甩片进行了抗 Centrin 抗体和人自身免疫性疾病抗中心体 血清的间接免疫荧光实验 抗 Centrin 抗体的染色显示 在有的细胞中的清晰的一对着色点 而在有的细胞中有很多着色点 这些着色点可能是纤毛基体的着色 图 5 A 人抗中心粒血 清的着色点要比抗 Centrin 抗体的大的多 图 5 B 6 图 5 担轮幼虫分散的单细胞抗 Centrin 抗体和人抗中心体抗体染色 A 图为担轮幼虫分散的单细胞抗 Centrin 抗体染色 PI 染核 显示在有的细胞中可见明显的成对的点 白 箭头所指 在有的细胞中在距核较远的部位有很多较密集的着色点 黑箭头所指 B 图为人自身免疫性疾病抗中心体血清的染色 PI 染核 显示着色点比抗 Centrin 抗体的着色点大很多 而且每个细胞只有一对 3 4 RT PCR检测检测HsCEN1同源基因在单环刺螠精子变态分化过程中及成体组织 中的表达 同源基因在单环刺螠精子变态分化过程中及成体组织 中的表达 经过静沉可分离得到 90 左右纯度的无鞭毛的精子细胞团和有鞭毛精子簇 提取静沉 所得的无鞭毛的精子细胞团 精子簇 体腔球及从肾管中得到的精子 剪取的体壁组织 消 化道组织的总 RNA 以它们为模板 以 HsCEN1 保守序列的特异引物进行 RT PCR 检测 HsCEN1 同源基因在单环刺螠中的表达 结果如图 6 所示 在无鞭毛的精子细胞团 精子簇 精子中都扩增出特异性片段 159bp 而在体壁组织 体腔球和消化道组织中则没有表达 3 5 RT PCR 检测单环刺螠早期发育中检测单环刺螠早期发育中 HsCEN1 同源基因的表达同源基因的表达 用未受精卵 A23187 处理 2hr 后孤雌激活的卵 受精 60min 后释放极体的卵 二细胞胚胎 多细胞胚胎 原肠胚 生出鞭毛开始游动的早期担轮幼虫和成体体壁组织的总 RNA 为模板 以 HsCEN1 保守序列的特异引物进行 RT PCR 检测 HsCEN1 同源基因在单环刺螠早期发育 中的表达 结果如图 7 结果显示 在未受精卵中 没有特异性条带 而在用 A23187 处理 孤雌激活 2hr 的卵中及受精后 60min 的释放极体的卵中 则有特异性条带 159bp 以后 随着胚胎发育的进行 二细胞胚胎 多细胞胚胎 原肠胚 早期担轮幼虫都有特异性条带 而在成体体壁组织中则没有表达 提示 HsCEN1 同源基因在单环刺螠中是在受精后开始表 达的 而到成体体壁则没有表达 表明由幼虫变态成为成体的某个阶段 HsCEN1 同源基因 停止了表达 3 6 RT PCR 检测检测 HsCEN2 HsCEN3 同源基因在单环刺螠中的表达同源基因在单环刺螠中的表达 用 HsCEN2 HsCEN3 的特异性引物对以上样品进行 RT PCR 检测 结果在所有的样品 中都没有出现特异性条带 结果未显示 7 图 6 单环刺螠精子变态分化过程中及成体不同组织中 HsCEN1 同源基因的表达 1 maker 2 无鞭毛的精子细胞团 3 精子簇 4 精子 5 体壁组织 6 体腔球 7 消化道组织 8 阴性对 照 可见在 2 3 4 中在 160bp 左右都有特异性条带 2 图 7 单环刺螠早期发育中 HsCEN1 同源基因的表达 1 marker 2 未受精卵 3 A23187 激活 2hr 后的卵 4 受精 60min 后释放极体的卵 5 二细胞胚胎 6 多 细胞胚胎 7 原肠胚 8 早期担轮幼虫 9 成体体壁组织 10 阴性对照 可见在 2 中没有特异性条带 3 4 5 6 7 8 中都有特异性条带 而在 9 中也没有特异性条带 4 讨论讨论 4 1 Centrin 在精子变态分化过程中的表达及其功能在精子变态分化过程中的表达及其功能 本研究检测了 Centrin 在单环刺螠精子变态分化过程中的表达 间接免疫荧光显示在不 同时期的精子细胞 精子簇 精子中都有 Centrin 的表达 RT PCR 结果显示 在精子细 胞 精子簇 精子中有 HsCEN1 同源基因的表达 而成体体壁组织 体腔球 消化道组织 中没有 HsCEN1 同源基因的表达 该结果说明 在成体内 HsCEN1 同源基因在精子变态分 化过程中特异性表达 间接免疫荧光结果还显示在精子发生过程中 从精子细胞到精子 Centrin 的特异性染色点数由两个变成了一个 该结果与 Schatten G 等人 1994 1 对人以及 爪蟾精子发生过程和 Manandhar G 等人 2000 9 对恒河猴精子发生过程中的 Centrin 表达 的研究结果相符 在他们的精子发生过程中都有 Centrin 的特异性表达 而且 由于到精子 时发生了远端中心粒的退化及 Centrin 表达量下降 我们的间接免疫荧光结果显示 早期精 子细胞在中心粒的位置有两个明显着色基本相当的着色点 到晚期精子细胞中则发现有一个 点的染色减弱 到精子簇及精子时只能看到一个着色点 这表明在单环刺螠精子变态分化过 程中 也可能发生了远端中心粒的退化 从而导致退化的中心粒不着色或着色浅在光镜下无 法检测 要证明这一点需要免疫电镜进一步研究 但我们的研究结果与孙晓东等人 11 和 Manandhar G 等人 9 对鼠精子发生过程的 Centrin 表达研究所得结果不同 在他们的研究 8 中都揭示了在鼠的精巢组织中有 MsCEN1 的特异表达 而到精子时 Centrin 蛋白则完全丢失 Centrin 在受精作用中的作用并不清楚 但孙晓东 16 等人在研究男性不育病人的精子时发现 Centrin 在病人精子的鞭毛中有不正常分布 因此可能 Centrin 的表达量及在精子中的分布对 受精作用的完成起着重要作用 虽然在低等真核生物中 Centrin 与鞭毛的切除有关 17 在人和牛中 受精后细胞内钙的 升高可能促使 Centrin 诱导精子尾部轴丝从基体断开 18 但从我们对单环刺螠精子簇间接免 疫荧光的结果可以推测 Centrin 可能还与精子尾部的定向有关 因为在精子簇中抗 Centrin 抗体的着色点有一定的方向性 与尾部的朝向相一致 从以上结果我们推测 Centrin 在动物精子发育过程中可能参与了减数分裂和精子变态 过程及精子鞭毛形成过程中的定向 在受精作用中可能与精子尾部从基体断开有关 4 2 Centrin 在单环刺螠卵与早期发育中的表达及其功能在单环刺螠卵与早期发育中的表达及其功能 我们的 RT PCR 结果显示 在未受精卵中没有 HsCEN1 同源基因的表达 但受精 60min 后的释放极体的卵中有明显的表达 可能是受精作用诱导了卵母细胞 HsCEN1 同源基因的 表达 也可能是所进入的精子的 HsCEN1 同源基因的表达 于是我们用钙载体 A23187 孤雌 激活卵母细胞 30umol L 的 A23187 处理卵母细胞 120min 后 有 90 以上甚至 100 的激 活率 但减数分裂进程放慢 100min 后才有少量卵排极 200min 后出现少数出现卵裂 我 们于激活后 120min 提取其总 RNA RT PCR 结果显示有特异性条带 表明孤雌激活诱导 了 HsCEN1 同源基因的表达 由于 A23187 的孤雌激活机制是引起与受精作用相似的 Ca2 内流而导致卵的激活 因此我们认为可能是由于 Ca2 的大量内流引起了 HsCEN1 同源基因 的表达 这一点目前未见相关报道 RT PCR 结果显示在单环刺螠的早期胚胎发育过程中 从二细胞期到早期担轮幼虫都 有 HsCEN1 同源基因的表达 而在我们检测过成体的组织中都未见表达 表明 Centrin 在单 环刺螠早期发育中有重要作用 在发育早期 双方配子中的中心体必需成分进入合子 海胆和非洲爪蟾在受精前 卵子 中的中心体是没有活性的 而精子的中心体也没有完全具备使微管开始聚集的能力 来自卵 细胞的新增蛋白加入到新生的精子中心体和由此伴随的这些成分的磷酸化过程促进了精子 星状体的活化 受精作用过程中中心体重建是激发胚胎发育的必需步骤 经典的研究 1901 boveri 显示大多数动物精子对中心体结构起决定作用 因为由放射性微管构成的精子的星体在单精 受精作用中集中在紧邻精子核的细胞质中 尽管多精受精中多个精子星体的出现支持中心体 是父本起源的的假说 但孤雌生殖和鼠受精作用的研究证明卵母细胞拥有重建母本中心体的 机制 该中心体能复制并能形成有功能的有丝分裂纺锤体极体 本研究中 单环刺螠卵的孤 雌激活导致了 HsCEN1 同源基因的表达 也是卵母细胞拥有重建母本中心体的机制的一个 佐证 单环刺螠担轮幼虫的分散的单细胞抗 centrin 抗体的间接免疫荧光显示 在有的细胞中 有很多着色点 由于担轮幼虫是纤毛类幼虫 体表有很多纤毛细胞 因此这些着色点可能是 纤毛基体的位置 由于我们使用的单细胞是胰酶消化后得到的 纤毛已脱落 要确认我们的 判断还要超薄切片的免疫电镜观察 Michel Ledizet 等人 19 20 在对气管上皮纤毛细胞的研究 中也在纤毛细胞中得到大量的 centrin 特异性点状分布 并用电镜观察证实了 centrin 定位在 纤毛基体中 由于从二细胞到担轮幼虫时期的单环刺螠的早期胚胎发育过程中都有 HsCEN1 9 同源基因的表达 而担轮幼虫的纤毛基体又需要 Centrin 因此 centrin 在单环刺螠的早期发 育过程中 参与基体的形成可能是其功能之一 而在成体的组织中没有 HsCEN1 同源基因 的表达 也似乎能间接证明这一点 因为在单环刺螠的发育过程中有一个由浮游生活变态到 底栖生活即纤毛消失的过程 是不是在这个过程中 HsCEN1 同源基因的表达停止了 还有 待进一步研究 总之 Centrin 在单环刺螠的受精作用及早期发育过程中 可能参与了合子中心体的重 建 也可能在其后的极快的早期卵裂中发挥重要作用 另外在单环刺螠中 Centrin 还可能 是形成担轮幼虫的纤毛基体的形成所必需 另外我们还用 HsCEN2 HsCEN3 的特异性引物对我们 HsCEN1 检测过的所有样品进 行了 RT PCR 检测 结果都没有出现特异性条带 可能是引物的同源性问题 也可能是在单 环刺螠中没有这两种基因的同源基因 这需要进一步验证 参考文献参考文献 1 Salisbury J Baron A 56 4 502 11 10 Manandhar G Moreno RD Simerly C Toshimori K Schatten G Contractile apparatus of the normal and abortive cytokinetic cells during mouse male meiosis J Cell Sci 2000 Dec 113 Pt 23 4275 86 11 孙晓冬 马静 葛烨华 王永潮等 中心体蛋白 centrin 在大鼠精子发生过程中的表达 解剖学报 2001 32 3 255 259 12 Tsai CW Wolniak SM Cell cycle arrest allows centrin translation but not basal body formation during spermiogenesis in Marsilea J Cell Sci 2001 Dec 114 Pt 23 4265 72 13 Klink VP Wolniak SM Centrin is necessary for the formation of the motile apparatus in spermatids of Marsilea Mol Biol Cell 2001 Mar 12 3 761 76 14 Hart PE Wolniak SM Molecular cloning of a centrin homolog from Marsilea vestita and evidence for its translational control during spermiogenesis Biochem Cell Biol 1999 77 2 101 8 15 Hart PE Wolniak SM Spermiogenesis in Marsilea vestita a temporal correlation between centrin expression and blepharoplast differentiation Cell Motil Cytoskeleton 1998 41 1 39 48 16 孙晓冬等 中心体蛋白 Centrin 在不育病人精子中的异常表达 科学通报 2002 47 139 141 17 Sanders M 10 9 2955 69 19 LeDizet M Beck JC Finkbeiner WE Differential regulation of centrin genes during ciliogenesis in human tracheal epithelial cells Am J Physiol 1998 Dec 275 6 Pt 1 L1145 56 20 Jamila Laoukili Eric Perret Sandrine Middendorp et al Differential expression and cellular distribution of centrin isoforms during human ciliated cell differentiation in viro J Cell Sci 2000 113 1355 1364 10 The Expression of Centrin in Sperm Differentiation and Early Embryonic Development in Urechis unicinctus Tang Yongzheng Ocean School of Yantai University 264005 Abstract In this study expression of centrin during Urechis unicinctus spermatid defferentiation is analyzed with anticentrin polyclone antibody The results show not only that expression of centrin is present through whole differential process from early and late spermatid to sperm but also that