淋病等实验室诊断技术玉林课件

性传播疾病的实验室诊断 广西区性病中心实验室广西皮肤病防治研究所中心实验室广西皮肤病医院检验科朱邦勇2015 11 20 性病实验室诊断在性病防治中的作用 效果评价 临床服务 疫情监测 科学研究 实验室诊断 实验室诊断在性病防治中的作用 经典性病 监测性病 梅毒淋病软下疳性病性淋巴肉芽肿 梅毒淋病软下疳性病性淋巴肉芽肿非淋菌性尿道炎生殖器疱疹尖锐湿疣HIV AIDS 新的方法监测的性病 梅毒淋病生殖道沙眼衣原体感染生殖器疱疹尖锐湿疣HIV AIDS 性病实验室诊断在性病防治中的作用 冰山一角 感染者 有症状者 就诊者 正确诊断者 接受治疗者 治愈者 在性病临床服务中的应用 确诊有症状的病例实验室检测对有症状的性病患者可以提高临床诊断的特异性 达到明确诊断的目的 发现无症状的感染有些性病感染者 特别是女性 在感染后往往不表现出典型的症状 或症状轻微 对于这类人群只有通过实验室检测方法才能发现其感染 从而减少由于感染后未能得到及时的治疗而引起严重的并发症及后遗症以及造成新的传播 在性病临床服务中的应用 指导临床实践了解病原体对药物的敏感性及其流行趋势 从而为临床治疗提供可靠的依据 保障治疗的有效性 此外 实验室检测对新药的推广应用和新治疗方案的效果评估也提供了必要的支持 观察疗效及判断治愈性病治疗效果的正确评价 有助于尽早切断传染源 预防并发症及后遗症的发生 临床疗效的判断往往需要借助于实验室的检测 性病实验室诊断的现状 梅毒 TPPA TPHA淋病 培养沙眼衣原体 核酸检测 EIA生殖器疱疹 抗原 抗体EIA尖锐湿疣 核酸检测 基本普及方法 梅毒 RPR TRUST淋球菌 涂片镜检沙眼衣原体 快速抗原检测 加强普及方法 支原体培养 广泛使用方法 淋病实验室诊断概况 病原学 1 淋病是指由淋病奈瑟菌 Neisseriagonorrhoeae 简称淋球菌 引起的各种化脓性感染 是一种经典的常见的性传播疾病 淋球菌为革兰阴性双球菌 大小约0 6 0 8 m 通常成对生长 两菌接触面平坦 概况 病原学 2 淋球菌与奈瑟属的另一种致病菌脑膜炎球菌及其他共栖奈瑟菌在生物学上有许多相似性 可通过生化特性加以鉴别 发性感染部位主要为男性尿道或女性宫颈管内膜 概况 流行病学 淋病的传播途径有以下二种 1 直接性接触感染 成人淋病几乎全部通过性接触感染 2 间接接触感染 儿童可通过污染了淋球菌的物品间接感染 新生儿可通过母亲产道分泌物间接感染 淋病的实验室诊断方法 直接显微镜检查淋球菌 分离培养淋球菌 非培养技术检测淋球菌细胞成份如抗原或DNA EIA PCR 标本的采集 取材部位依据年龄性别性接触方式临床表现 取材拭子种类藻酸钙拭子普通棉拭子涤纶拭子 标本的采集 取材部位 1 男性异性恋者 采集尿道标本 有口淫史者加取咽部标本 同性恋者 采集尿道 直肠及咽部标本 女性采集宫颈标本 必要时从尿道 直肠 咽部 前庭大腺和尿道旁腺取材 标本的采集 取材部位 2 幼女幼女和 或处女膜未破的感染者标本 采集阴道分泌物新生儿眼炎患者采集眼结膜分泌物 标本的采集 取材方法 1 尿道男性患者用手指从阴茎根部向尿道口方向挤压 有症状患者可挤出脓液 用取样拭子蘸取脓液作涂片或培养 对挤压后无明显分泌物时 采用男用取材拭子插入尿道2 3cm 稍用力转动 保留数秒钟再取出 以采集到粘膜上皮细胞 标本的采集 取材方法 2 尿道女性患者可抵着耻骨联合轻轻按摩尿道口 挤压出分泌物 如果无明显分泌物 可用同男性相似的上述方法取材 标本的采集 取材方法 3 宫颈避免使用防腐剂和润滑剂 因为这些物质对淋球菌有抑制作用 仔细检查阴道壁和宫颈 如果宫颈口外面的分泌物较多 先用无菌棉拭清除过多的宫颈粘液 将一取样拭子插入宫颈管内1 2cm 稍用力转动 保留10 30秒后取出 眼部用男性采样拭子在眼结膜处蘸取分泌物或轻绕眼结膜 标本的采集 取材方法 4 直肠将取样拭子插入肛门2 3cm 从紧靠肛环边的隐窝中取材 避免接触粪便 阴道青春期前女孩可采集阴道标本 将取样拭子置于阴道后穹窿10 15秒 采集阴道分泌物 咽部从咽后壁或扁桃体隐窝取材 标本的运送 淋球菌的抵抗力弱 对热敏感 不耐干燥 取材后标本若不能立即接种于选择性培养基上时 需采用运送系统 置于非营养型运送培养基中的标本应在12小时内送到实验室 接种于选择性培养基 分离阳性率可达90 以上 超过24小时则分离阳性率下降 直接显微镜检查 染色方法 革兰染液美兰染液姬姆萨染液荧光抗体革兰染色为一传统方法 因简便 快捷及价廉 仍然为最广泛采用的方法 革兰染色将菌分为二大类 即染成紫色的革兰阳性菌及染成红色的革兰阴性菌 革兰染色 细胞内革兰阴性双球菌 直接显微镜检查的临床意义 男性淋菌性尿道炎的尿道标本敏感性及特异性可高达95 99 具诊断价值 宫颈标本 无症状男性尿拭子及取自直肠的涂片时敏感性仅40 70 不推荐直接显微镜检查诊断直肠和咽部淋球菌感染 亦不能用于疗后判愈 如果在多形核细胞外见到形态典型的革兰阴性双球菌 需做培养进行确证 淋球菌镜检报告格式 1 革兰氏阴性双球菌2 细胞内外3 该细胞指的是什么细胞规范格式 细胞内外见到革兰氏阴性双球菌或细胞内外未见到革兰氏阴性双球菌 24 美国 中国 美国和中国淋病病例性别分布比较 淋球菌培养 培养法为诊断淋病的金标准 对女性淋病的确诊应做淋球菌培养从选择性培养基上分离出淋球菌即可诊断淋病 培养的敏感性81 100 培养的优点有 特异性极高 100 可发现无症状淋球菌感染患者 可确诊儿童性虐待 可用于进一步作药敏试验 可用于治疗后的判愈试验 淋球菌培养 选择性培养基评价培养基质量的一个重要指标 男性淋菌性尿道炎标本的革兰染色与培养的符合率应达95 100 如果革兰染色阳性 培养阴性的比率较高则表明选择性培养基的质量欠佳 淋球菌培养 接种标本取材后标本应尽可能及早接种 培养基应先置于室温或孵箱中预温 将取材的拭子转动涂布于平皿的上1 4范围 然后用接种环分区划线 以保证获得较纯的单个菌落 接种标本 四区划分接种 接种标本 四区划分接种 淋球菌培养 培养条件 35 36 含5 10 CO2 湿润 70 湿度 的环境 CO2环境可由CO2培养箱 CO2产气袋及烛缸提供 使用烛缸时 应使用白色 无芳香味的无毒性蜡烛 在烛缸底部放些浸水棉球以保持一定的湿度 培养时间 24 48小时 淋球菌培养 观察结果 淋球菌培养 淋球菌的初步鉴定 初步鉴定淋球菌的主要依据菌落特征氧化酶试验革兰染色 淋球菌培养 淋球菌的确证试验 来自泌尿生殖道符合初步鉴定标准的分离株 一般可诊断为淋球菌 准确性达98 对于菌落形态不典型的分离株 来自咽部 眼睛 或其他泌尿生殖道外部位的分离株 来自低危人群 如儿童 的分离株 以及涉及医疗法律案例的分离株 应作确证试验 淋球菌培养 淋球菌的确证试验 糖发酵试验免疫学试验 荧光抗体染色 协同凝集试验酶底物试验DNA探针试验 糖发酵试验 糖发酵试验检测奈瑟球菌分解特定糖类 葡萄糖 麦芽糖 乳糖及蔗糖 产酸的能力 根据淋球菌仅分解葡萄糖 脑膜炎球菌分解葡萄糖和麦芽糖 乳屑奈瑟球菌分解葡萄糖 麦芽糖 蔗糖或不分解这些糖类 可将淋球菌与可能在淋球菌选择性培养基上分离出的其他奈瑟球菌加以鉴别 糖发酵试验 奈瑟球菌属的糖发酵特征 淋球菌的鉴定特征 非培养诊断技术 核酸检测 核酸检测的特点不依赖于活的病原体的存在 无需特殊运送条件 仅适合尿道或宫颈标本 以及尿液 不能进行抗生素敏感性试验用于判愈试验需在治疗后至少3周以上进行 淋球菌耐药检测 淋球菌耐药检测方法 琼脂纸片扩散法Etest琼脂稀释法分子生物学方法 耐药基因检测 琼脂纸片扩散法 琼脂稀释法 将待检菌接种到含有不同浓度抗菌药物的琼脂平皿上 抗菌药物浓度小时细菌生长 浓度大时细菌生长被抑制 据此可测出该菌株最低抑菌制浓度 MIC 判断对抗菌药物的敏感性 此法主要用于耐药监测 MIC是指抗菌药物能够抑制细菌生长的最小抑菌药物浓度 表示单位为 g ml Etest 淋球菌耐药监测 内容与方法 监测药物青霉素头孢克肟四环素阿奇霉素大观霉素头孢曲松环丙沙星 NGcasesin2006 3 000 GRSPsitesin1987 2003 GRSPsitesin2004 2006 GRSPsitesin2007 1987 个省1992 2006 5个省2007 2009 个省2010 201210个省 12点 中国淋球菌耐药监测网络 2006 2012年间广西南宁地区淋球菌对头孢曲松 大观霉素 环丙沙星 TRNG和PPNG的变化趋势 2014年南宁地区淋球菌对抗生素敏感性 淋球菌耐药监测项目 1 开展时间1987年至2015年 连续监测28年2 课题 卫生厅课题 2014年 一项科技厅课题 2007年 一项3 文章 总共发表文章近15篇 皮研所 其中大部分为国家级核心期刊论文 一篇SCI文章 中华医学会系列杂志4篇 性病门诊检查发现存在的问题 淋病 1 淋病缺少治疗药 大观 菌必治等 2 未开展淋球菌培养项目3 女性淋病仅涂片显微镜检查就诊断和报病4 淋球菌培养未按要求使用淋球菌培养基 沙眼衣原体的病原学沙眼衣原体的分类与致病性沙眼衣原体泌尿生殖道和婴幼儿感染的实验室诊断 沙眼衣原体感染的实验室诊断 一 沙眼衣原体病原学 严格细胞内寄生生活特性 原体和始体 正常生活周期持续性感染 分类 沙眼 性病淋巴肉芽肿和鼠生物变种Serovar A B Ba C D E F G H I K L1 L2 L3B群 B Ba D E L1和L2C群 A C H I J K和L3中间群 G和F 二 沙眼衣原体分类与致病性 三 沙眼衣原体泌尿生殖道感染的实验室诊断 检测方法 直接涂片法免疫学方法 ELISA IFA 胶体金法细胞培养法分子生物学方法 标本的采集 泌尿生殖道感染 男性 尿道拭子 尿沉渣和EPS等 女性 宫颈拭子 阴道拭子等 直接涂片法 姬姆萨染色 方法 涂片 姬姆萨染色 镜检包涵体 沙眼衣原体包涵体姬姆萨染色临床应用 眼部感染 敏感性95 男性尿道 敏感性15 宫颈感染 敏感性41 应用范围 眼部标本 沙眼衣原体免疫荧光法检测临床应用敏感性 74 90 高特异性 98 99 高缺点 主观性 荧光显微镜临床应用 快速检测非培养法阳性标本的确证 ELISA法原理 Ab Ag Ab 酶 底物 显色方法 加入标本 孵育后洗板 酶标抗体 孵育后洗板 底物 孵育 终止液 机读或肉眼读 免疫胶体金快速法 原理 方法 拭子 I液 80C10分 冷5分 滴加5滴 15分读结果结果 阳性 质控窗 结果窗 阴性 质控窗 结果窗 失败 质控窗 结果窗 免疫胶体金快速法检测临床应用敏感性 33 3 49 7 低特异性 88 1 99 2 高缺点 需要确证 不宜质控操作临床应用 临床症状典型病例的检测不适合非典型感染的筛查 细胞培养法 原理 衣原体在瘤细胞生长 染色检测方法 制备McCoy细胞接种标本 2500转 1h 去上清加新培养液 培养48 72 检测 碘或姬姆萨染色 荧光法 细胞培养法检测临床应用敏感性 52 92 低特异性 99 100 高缺点 实验室条件和实验技术要求高 费时 敏感性低临床应用 金标准 方法方法学评价沙眼衣原体感染的确证沙眼衣原体感染的科研 分子生物学检测临床应用敏感性 75 97 高特异性 98 100 高缺点 实验室条件和技术要求高 成本高 费时 假阳性 抑制物临床应用 临床和健康体检沙眼衣原体感染的筛查 生殖器疱疹的实验室诊断 概述 生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒 HSV 感染泌尿生殖器及肛门部位皮肤粘膜而引起是一种复发性疾病 是一种常见的性传播疾病 HSV是双链DNA病毒 属人类疱疹病毒 亚科 人类是HSV的唯一自然宿主 HSV有两种类型 单纯疱疹病毒1型 SHV 1 和单纯疱疹病毒2型 HSV 2 多数生殖器疱疹是由HSV 2引起 HSV可呈慢性复法过程 尚无彻底治愈的方法 概述 生殖器疱疹的复发可给患者带来很大的身体痛苦 影响其生活质量 并可能引起播散性HSV感染 病毒性脑膜炎 脊髓脊神经根病 盆腔炎综合征等一系列并发症 孕妇HSV感染影响生育 可引起子宫内新生儿的感染那 导致流产 早产 死产 新生儿死亡或发生严重疑症 概述 传染源 生殖器HSV感染者 亚临床感染或无症状派读者 未识别症状或不典型生殖器疱疹患者是生殖器疱疹的主要传播源传播途径有水平传播和垂直传播 水平传播主要是性接触传播 垂直传播是指母 婴及母 胎儿间传播 包括子宫内感染和经产道感染 标本采集 复发性生殖器疱疹病程1 2周 病毒排放持续平均时间4天 原发性病程2 3周 病毒排放持续时间12天 1 疱液取材 2 溃疡取材 3 宫颈取材 4 其他标本如尿道拭子 丘疹等 标本采集 标本运送 如不能立即检测 应将标本洗入病毒运送液 置冰箱保持 如当天检测可置4 保存 如不能当天检测 应置 70 保存 实验方法 1 分离培养法2 细胞学检查3 直接免疫荧光法4 单纯疱疹抗原酶联免疫试验5 HSV DNA或基因检测法6 血清学检测 病毒分离培养 原理 培养法分离培养HSV 每天观察病毒对敏感细胞的细胞病变 CPE 初步确定病毒的存在 方法 单层细胞的准备 标本接种 细胞病变的观察 病毒传代 鉴定与分型 病毒培养 结果 培养超过4天后可以观察CPE 可初步确定HSV培养为阳性 如要确认需经过免疫学方法进一步鉴定证实 注意事项 1 细胞的敏感性 选敏感性好及活力强幼龄细胞 2 标本取材时不应使用消毒剂和润滑剂及藻酸钙拭子 3 标本中病毒含量 4 保存 5 注意无菌操作 避免细菌