设计性试验 菠菜色素的提取和分离.doc

设计性实验 菠菜色素的提取和分离班级：09精细化工学号：200924102128姓名：邓树广【摘 要】 介绍了实验室中利用色层层析法分离菠菜色素的一种方法。首先采用不同的溶剂通过浸泡、研磨提取出菠菜色素，再利用薄层色谱测定了叶绿素、胡萝卜素和叶黄素的Rf值以选择合适的展开剂。利用各种色素的极性不同，使用柱色谱对叶绿素（a,b）、胡萝卜素和叶黄素进行了分离。【关键词】 菠菜色素；色谱法；Rf值；薄层层析；柱层析【前言】菠菜叶等绿色植物中含有叶绿素（绿色）、胡萝卜素（橙色）和叶黄素（黄色）等多种天然色素。叶绿素在菠菜色素中含量最多，易溶于醚，石油醚等一些非极性溶剂。叶绿素存在两种结构形式，可分为叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O5N4Mg），叶绿素a的含量约是叶绿素b的3倍。它们两者均是植物进行光合作用所必需的催化剂，同时也是天然的食用绿色色素, 可用于糕点、饮料水等。 胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的多烯，也可作为食品工业中的色素使用。它有三种异构体，分别是-,-和-胡萝卜素。其中的-异构体具有维生素A 的生理活性, 可代替维生素A 使用。叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，易溶于醇，在石油醚中溶解度较小。叶黄素在光合作用中起收集光能的作用，在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。由此可见，叶绿素等天然色素有广泛的用途, 天然色素的提取与分离是一个具有重要意义和价值的课题, 同时我们可以通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法。1实验部分1-1实验仪器与试剂实验仪器：研钵、层析瓶、载玻片、层析柱、分液漏斗、锥形瓶（5个）、小烧杯（2个）、毛细玻璃管、量筒。实验试剂：丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚(沸点60 90 )、无水硫酸钠，均为分析纯。薄层层析硅胶G、新鲜菠菜叶。1-2 实验原理 色谱法的基本原理：色谱法是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以获得分离的方法。利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行反复的洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离各个组分的效果。 比移值（Rf值）：薄层色谱法中样品中某成分在纸层析或薄层层析特定溶剂系统中移动的距离与流动相前沿的距离之比叫做该种成分在此溶剂中的比移值。（R f = 原点至层析斑点中心的距离溶剂前沿到原点的距离）。比移值衡量某物质在一定溶剂中溶解性和扩散速度。菠菜中含有的主要色素包括叶绿素（a, b），叶黄素和胡萝卜素(，)，他们彼此的极性不同（Rf值不同），可以用柱色谱将它们分开。 柱色谱法：将已经溶解的样品加到已装好的色谱顶端，使其吸附在吸附剂上然后用洗脱剂进行洗脱，流体（流动相）带着混合物的组分下移。经过反复的吸附和解吸后，各种组分在柱色谱上形成不同的色带。由于各组分的极性不同，用不同洗脱剂洗脱各个色带并且予以收集即可得到单一的色素。1-3 实验方法 菠菜色素的提取: 取15 g洗净且用滤纸吸干的新鲜菠菜叶, 用剪刀剪碎并与15 mL的石油醚丙酮混合液( 体积比32)拌匀, 在研钵中研磨约5 min, 然后用布氏漏斗轻微抽滤, 弃去滤液；再将菠菜汁放回研钵, 适当研磨, 用15 mL 乙酸乙酯丙酮混合液( 体积比32) 萃取, 轻微抽滤；最后用15 mL乙醇丙酮混合液( 体积比32) 萃取。将每次的提取液用滴管转移到分液漏斗, 然后用10 mL 水洗涤两次, 以除去萃取液中的乙醇( 洗涤时轻轻振荡,以防止乳化，并且及时放气) , 弃去水-乙醇层。石油醚层用无水硫酸钠干燥后倾至圆底烧瓶, 在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1 mL。 薄层层析、测定Rf值： 制作层析板：将薄层板用硅胶G经过0.5羧甲基纤维素钠调制后制版，晾干后在110, 活化1 h, 冷却, 置于干燥器中备用。点样、色素的展开: 取活化后的层析板，在距层析板一端1.5cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线，用毛细玻璃管粘取菠菜色素提取液, 小心点滴在制好的薄层板上, 样点间相距11.5cm，样点直径不应超过2mm，滴在硅胶板上的提取液要成一条直线, 直线离板下沿约1. 5 2 cm , 晾干。放入装有32 石油醚- 乙酸乙酯混合展开剂的层析缸内（注意不要让展开剂浸到提取液点），于室温展开, 得到不同的色斑。取出, 待溶剂挥发后, 测量各色带及溶剂前沿到原点的距离, 按公式计算R f 值。柱层析:安装层析柱：将层析柱固定好在铁架台上下端放一个小烧杯。用30-40ml石油醚和9g硅胶G混合在小烧杯中充分搅匀，慢慢在注入到201.0cm层析柱中。打开下端旋塞，使石油醚流出（注意不能使硅胶露出石油醚液面以上，要防止柱内出现气泡，可用洗耳球轻拍柱身使硅胶堆积更致密，赶走气泡），重复操作直至将所有硅胶注入到层析柱中形成吸附剂柱。完成后在层析柱顶端放上一片比管口略小的滤纸，用玻璃棒使其贴紧硅胶上端面。进行层析：打开层析柱下端旋塞使石油醚液面下降到离硅胶上端面约1mm处，用滴管将菠菜色素提取液小心滴到层析柱顶端。关闭下端旋塞，用滴管滴加少许石油醚，打开下端旋塞。重复几次，使色素全部进入柱体后，用胶头滴管小心加入洗脱剂进行色素的分离。依次用5:1，2:1，3:1石油醚-丙酮混合洗脱剂洗出胡萝卜素（橙色）、叶绿素a（蓝绿色）、叶绿素b（黄绿色）和叶黄素（黄色）各种不同色素并且收集回收。1-4 实验的注意事项蔬菜叶须注意不可研磨的太烂而变成糊状导致分离困难。叶绿体色素对光,温度,氧气,酸,碱及其它氧化剂都非常敏感,故色素的提取和分离须尽量避光。通常覆盖一小张滤纸来保护硅胶（固定相）的表面,它应当低于洗脱剂的表面。在洗脱过程中,不要大量放出溶液,以免固定相表面暴露导致柱子干裂。层析柱应保持垂直,并且柱内应当没有气泡。气泡或倾斜的顶部会使得流出柱体的化合物的色带易变形。1-5实验结果与分析实验测得的各色素的Rf值胡萝卜素叶绿素a叶绿素叶黄素Rf值（32 石油醚-乙酸乙酯）0.960.320.230.07文献中Rf值0.960. 530.420.25 从实验数据可以看出按R f 值由大到小依次是胡萝卜素叶绿素叶黄素。其中胡萝卜素的展开速度最快，极性最小，硅胶对它的吸附能力也最小，所胡萝卜素可以最先洗出。在32 石油醚- 乙酸乙酯中叶绿素a和叶绿素b的Rf值差不大（只有0.9），可以看出使用此展开剂展开剂时叶绿素a、叶绿素b、脱镁叶绿素没有被很好展开, 出现部分堆叠。据查所资料，在两者差为0.2-0.5之间的时候表明所用的展开剂是比较适宜的。换而言之，32 石油醚- 乙酸乙酯混合展开剂对叶绿素a和叶绿素b的区分效果不是特别好，可以适当调整展开剂的极性。 实验最后分离出了菠菜色素中的胡萝卜素、脱镁叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素五种色素。影响柱层析效果的因素有：层析柱过高,会造成色谱分散,颜色不明显,分离效果不理想。层析柱过低,色谱不整齐,效果也不好。萃取液数量一般在1525 mL较好。过少萃取的色素少,层析效果不好；过多,则浪费药品。洗涤时不要激烈振荡以防止提取液乳化。抽滤时不要过多用力把混和液连同菠菜汁液全部挤出,这样可能会导致不能分层。层析柱要紧密,不要让干柱出现断层,也不要有过多气泡,否则分离效果不好。所加入的浓缩液应该保持在12 mL,不宜过多，过多会造成色谱分散,过少 会造成色谱不整齐。2 参考文献 郝卫东、孙国建、 赵胜芳； 菠菜叶中色素成分的分离和鉴定，黄冈师范学院报第28 卷第3期 2008 年6 月 李好样、冯轶雪； 菠菜色素的提取与分离， 太原师范学院学报( 自然科学版) 第3 卷第3期 2004 年9 月 马骏、王超、