蓝莓提取花青素.doc

蓝莓中提取花青素北京科技大学生物技术0902 刘炎峻摘要：蓝莓是杜鹃花科越桔属植物，在我国有丰富的蓝莓资源，蓝莓果中含有丰富的营养成分，特别是花青素。花青素又称花色素，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，由于花色素不稳定，在植物中主要以花色苷存在。本文介绍了花色苷的提取方法，溶剂萃取法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法和酶法等，及分离纯化的方法，吸附解析法、膜分离法、酶法等，并对各个方法进行了介绍与分析,并对国内外蓝莓花青素市场提出了看法。关键词： 蓝莓 花青素 花色苷 提取Abstract: blueberry is the Ericaceae genus plants, in my state-owned and rich blueberries blueberry fruit resources, rich in nutrients, particularly anthocyanins. Anthocyanins and flower pigments, is a kind of widely exists in plants of water-soluble natural pigment, belongs to a kind of flavonoids, due to instability in plants flower pigments, mainly in the presence of anthocyanins. This paper introduces the method of extracting anthocyanins from, solvent extraction, supercritical fluid extraction, ultrasonic assisted extraction method and enzyme method, separation and purification method, adsorption and analytic method, membrane separation method, enzyme method, and the various methods were introduced and analysis， and puts forward the view of blueberry anthocyanins to domestic and international market.Key words: blueberry anthocyanins anthocyanins extraction1 蓝莓与花青素1.1 蓝莓蓝莓(Blueberry),又名越桔、蓝浆果、红豆果等,为杜鹃花科越桔属植物,呈灌木。蓝莓共有450多种不同的品种,分布于亚寒带、温带及亚热带。蓝莓果中含有丰富的营养成分,除含有一般水果中的有机酸、维生素和矿物质外,还含有丰富的不饱和脂肪酸及微量元素，花青素、黄酮等多种酚类生理活性成分。蓝莓具有极强的药用价值和营养功能，被国家粮农组织将其列为五大健康食品之一。近几年发展迅速，市场容量大。按照产业的长远发展看，增加蓝莓初加工以及深加工产品，延长产业链条，提升其产品附加值，势在必行。1.2 花青素花青素又称花色素（英语：Anthocyanidin），是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，其与糖类物质以糖苷键结合之后即为花色苷，是一种天然的抗氧化剂。由于花色素不稳定，在植物中主要以花色苷存在。花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用，在食品、化妆、医药等方面有着巨大的应用潜力。花青素是纯天然的抗衰老的营养补充剂，研究证明是当今人类发现最有效的抗氧化剂，是目前自然界最有效的抗氧化物质。同时有研究称可增强视力，消除眼睛疲劳；延缓脑神经衰老。 而且，蓝莓所含花青素是目前所有植物花青素中功能最优良（尤其是有16种生物类黄酮组成的花青素，有比一般植物花青素更优越的生理活性）、应用范围最广，副作用最低，也是价格最昂贵的品种。花青素含量达25%的蓝莓提取物价格是含量达95%的葡萄籽提取物的56倍，可见其超凡的价值。蓝莓根、茎、叶、果皮、果肉中均含有花青素，且存在于蓝莓细胞的液泡中。1.3 蓝莓花青素理化性质（1） 蓝莓花青素属于水溶性色素。（2） 在pH小于3.0条件下比较稳定（3） 在60以下热稳定性较好，在短时间内有一定的耐高温能力。（4） 对光比较敏感（5） 耐氧化还原性差，氧化剂对蓝莓花青素的影响较大，还原剂V在低浓度下对蓝莓花青素的影响不大，因此使用时应避免与氧化性物质共存。（6） 蔗糖和柠檬酸使蓝莓花青素的稳定性增强。（7） 微波对其稳定性无不良影响2 花色素的提取与纯化2.1 花色素的提取花色苷的提取方法主要有溶剂萃取法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法和酶法等。其中溶剂萃取法是最常用提取方法，酶法为一种新的提取方法，尚未广泛应用。如果提取花色素的目的是为进一步定性或定量分析，则选择提取方法最好是不破坏它们的结构，保持天然状态;如果提取的花色苷作为食品添加剂用于食品着色，那么保持最大色素产率、颜色的强度以及稳定性是关键。蓝莓花色苷的提取有四种方法：（1） 溶剂萃取法对于蓝莓花青素这种水溶性花色苷多采用溶剂浸提，再经过滤，减压浓缩，真空干燥的方法。蓝莓花色素溶于水，甲醇，乙醇，丙酮，但不溶于乙醚石油醚，是水溶性色素。在中性或碱性溶液中不稳定，因此浸提液要采用酸性溶剂，酸性溶剂在破坏植物细胞膜的同时溶解水溶性色素。甲醇是最佳提取液，其提取效率比乙醇高20%，比水高73%。但由于甲醇的毒性，考虑作为食品添加剂的色素提取液的食品安全问题，所以可以用酸性乙醇溶液作为蓝莓色素的提取剂。无机酸(如HC1)的酸化溶剂可能会改变复合色素的天然形式，因为可能破坏花色苷与金属离子、辅色素之间的缔合，弱有机酸(柠檬酸最好，其次是酒石酸、甲酸、乙酸和丙酸)对花色苷结构的影响较小。因此可以在乙醇溶液中加入柠檬酸，可提高提取率，同时使蓝莓花青素的稳定性增强。有实验曾用含0.1 %的HCL的甲醇溶液提取，也有用蒸馏水，SO2，柠檬酸加热提取，但甲醇与SO2总会有试剂残留，并有毒性，不可取。乙醇量，温度，浸提时间，pH都会对蓝莓花色苷的提取长生影响。实验证明：花色苷在60%乙醇，料液比为1 g:15mL，40 ，提取时间2h，pH3.0，花色苷的提取量比较高。溶剂萃取法是目前天然食用色素生产的主要方法，其优点是投资少、设备简单，但存在能耗大等缺点。（2） 酶提取法用酶法提取为新方法，未广泛应用。蓝莓花色苷主要集中在被大量纤维素和果胶包围的果皮内，只有将纤维素和果胶解链才能将花色苷充分释放。所以可用酶法。果胶酶提取蓝莓花色苷对提高花色苷的提取量效果不明显，而纤维素酶解法可以大幅度提高花色苷的提取量。这可能由于纤维素酶破坏了细胞壁，释放出胞内物质，而果胶在果胶酶作用下的水解产物对花色苷的吸附性较强，使得花色苷提取量低于无酶作用结果。纤维素酶可使纤维素、半纤维素等物质降解，引起细胞壁和细胞间质结构发生局部疏松、膨胀等变化，从而增大胞内有效成分向提取介质的扩散，促进色素提取率的提高。纤维素酶解法提取蓝莓花色苷的最佳工艺参数为酶用量5mg/g，料液比1 g:8mL，酶解时间60min, pH5.0，酶解温度为45 。 酶提取花色素具有条件温和，酶用量少，提取率高等优点。（3） 超声波辅助提取法借助超声波提取花色苷是近年来发展的新技术。对于有些花色普类色素，有机溶剂不易渗透细胞壁和细胞膜，不能很好的将提取物从细胞器中溶出，使提取时间延长，而采用超声波辅助萃取可大大缩短时间，降低生产能源、溶剂消耗以及废物的产生，从而提高萃取效率。提取蓝莓色素，也可以用乙醇浸提液提取的同时辅助微波或超声波提取技术来提高花色苷的提取率。徐建国等曾采用0.01 %HCL的80%乙醇溶液的同时，辅助功率200W超声波，时间为15min，超声波法和溶剂浸提法的提取率分别为86.57%, 79.64%，提取率提高6.93%。超声波法与浸提法相比，所用乙醇浓度降低，提取时间缩短，色素提取率提高、色价提高。（4） 超临界流体萃取法超临界流体萃取法是新兴的一项萃取和分离技术，是使用高于临界温度，临界压力流体作为溶剂的萃取过程。处于临界点附近的流体不仅对物质具有极高的溶解能力，而且物质的溶解度随体系压力或温度变化而变化，从而通过调节体系的压力或温度就可以方便地进行选择性地萃取分离物质，常用C02作为萃取剂。此法特别适于萃取挥发性、热敏性或脂溶性色素，如辣椒红素、叶黄素和番茄红素。与溶剂萃取法相比，超临界流体萃取无化学试剂残留和污染，并可避免萃取物在高温下分解，保护生理活性物质的活性及保护萃取物的天然风味。对于蓝莓花色素来说，效果不是太明显。2.2 花色素的分离与纯化：经溶剂萃取后浓缩的天然色素大多是粗制品，其中仍含有胶质、淀粉、糖类、脂肪、有机酸碱、无机盐、金属离子等，甚至有特殊的异味。可以采用的方法有吸附解析法、膜分离法、酶法等。（1）吸附解吸法吸附解吸法常用的填料有大孔树脂、硅胶、聚酸胺、葡聚糖凝胶等。用大孔树脂吸附精制天然色素是提高色素纯度的有效方法，精制过程易于控制，并且树脂洗脱后可反复使用，节约成本。AB一8是弱极性，大孔树脂比表面积480520，平均孔径130140，主要用于甜菊糖、色素和有机物的提取分离，对色素有较强的吸附作用。有实验通过对10种大孔树脂的静态吸附解吸研究，发现AB-8型大孔树脂是一种比较理想的树脂，吸附率大，解吸率高，较适合蓝莓果中花色苷类成分的纯化。大孔树脂比表面比较大，可以利用范德华力进行物理吸附，大孔树脂吸附的是分子态的物质。解吸时用乙醇洗脱就是和大孔树脂进行对分子态的物质竞争吸附,使物质转为溶解于乙醇,从而被乙醇洗脱液带走。由此，可以除去杂质，进行分离纯化。如图所示，每一个大孔聚合物珠体都是由大量很小的微球凝聚而成，也既是由连续的凝胶相和连续的大孔相构成。在使用时孔中充满溶剂，吸附树脂的内表面暴露在溶质和溶剂分子中进行吸附。一般来讲，溶质的溶解度越小，越容易被吸附。蓝莓经过浸取液浸取，再经过除杂质，制备成供吸附的料液，将树脂预处理（乙醇加热回流洗脱）后，上柱吸附，饱和后采用乙醇等溶剂进行洗脱，最后树脂再生。（处理方法：树脂活化 乙醇浸泡24h 上柱 去离子水洗至中性 酸洗(5HC1)2h ，水洗至中性 ，碱洗(5NaOH ) 2h ，水洗至中性备用）AB-8型大孔树脂对花色素的吸附属多分子层吸附，静态吸附解吸条件为:吸附平衡时间为4h，吸附平衡最适浓度750mg/L, pH3.0时吸附能力比较强，低温有利于AB-8型树脂的吸附，而高温则有利于该树脂的解吸，用pH3.0的60%乙醇溶液作为解吸液，解吸平衡时间2h。动态吸附解吸条件为:吸附和解吸流速1 mL/min，上样液浓度3.Omg/mL，用5倍柱床体积的60%酸性乙醇作为洗脱液。（2）膜分离法根据生物膜对物质选择通透性的原理所设计的一种对包含不同组分的混合样品进行分离的方法。所以，可以在对浸提液进行精密过滤，或将过滤液进行浓缩的过程中，利用膜分离。比如，微滤膜，反渗透膜等。 （3）酶法天然色素粗制品中的杂质可以通过酶反应除去。酶的催化作用一般在常温、近中性的条件下进行，这对耐热性不强的天然色素特别适合。但蓝莓提取花色素的过程中，未有人研究用酶法进行分离纯化。（4）高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)应用于花色苷物质的分离具有分析时间短，分辨率高，无热分解的危险，需样量少等优点。但这主要使用与定性和定量研究。所以，蓝莓提取花色素主要用吸附解吸法（AB-8型大孔树脂）3 蓝莓花青素的主要提取流程下图是蓝莓花青素的主要提取流程：图一. 蓝莓花青素的主要提取流程蓝莓鲜果 蓝莓浆液 加浸提液浸提 过滤 离心 回收乙醇 滤液（花青素提取液） AB-8树脂吸附 乙醇洗脱 回收乙醇 石油醚萃取 减压浓缩 真空干燥 称取一定量新鲜蓝莓果打浆，按最佳提取条件浸泡后浸提，抽滤得紫红色蓝莓花青素提取液，将此色素提取液经AB一8大孔吸附树脂纯化，60乙醇溶液作为洗脱剂，收集样品经温度为60、真空度为88kPa下减压浓缩回收乙醇，再经真空干燥，则得紫红的晶体状或膏状蓝莓花青素。4 看法蓝莓具有极强的药用价值和营养功能。近几年发展迅速，市场容量大。增加蓝莓初加工以及深加工产品，延长产业链条，提升其产品附加值，势在必行。因此，如何让蓝莓提取花青素达到工业化生产要求，是重中之重。因为蓝莓更看重的是它的保健和药用功效，保持最大色素产率、颜色的强度以及稳定性，安全性是关键，同时还要考虑他的成本和是否可工业化。高畅;高欣;赵尔丰;程大海便发明了一种从蓝莓果渣中提取花青素的方法。他以生产果汁或果酒后的蓝莓果渣为原料，采用一体化酶空化混悬的培养提取技术提取果渣中的花青素。该方法简单易行，适用于工业化生产。（专利号： 201010032422），现市场已有几种含蓝莓花青素的保健品在售。至21世纪初，我国已形成包括吉林省、山东省和安徽省三大蓝莓种植基地，年产蓝莓鲜果已超过1万吨。但令人遗憾的是，国产蓝莓大多以蓝莓浓缩果汁或蓝莓粉、蓝莓浸膏等制成品出口海外（主要是日本等国），内销极少。至今除广东有厂家在生产“眼之宝”等蓝莓类护目保健产品（由日本庆应大学生物学博士高山峰博士为领导的科技公关小组和华东师范大学生命科学院联合成立的生命研究所，致力于中药产品国际化）外，极少有国内厂家生产蓝莓类保健食品。可以认为，我国虽已形成蓝莓种植产业，但尚未形成蓝莓眼保健食品产业链。蓝莓在西方国家已形成一个年产值十几亿美元的大产业。而我国的吉林和山东虽均有数千亩的连片蓝莓栽培基地，蓝莓种植基地已形成规模化生产，而且蓝莓鲜果的产量也在逐年提高，但国内的蓝莓类保健品市场尚未正式启动。5 参考文献1 王日为，张丽霞，高吉刚茶叶中花青素类物质研究展望J茶叶科学技术，2002 （4）：4-8 2 高爱红，童华荣天然食用色素一花青素研究进展J保鲜与加工，20