Western(试剂配制和操作步骤).doc

Western（试剂配制和操作步骤）试剂配制：（一）母液（二）使用液操作步骤：（一）蛋白样品制备（二）蛋白含量的测定（三）SDSPAGE电泳（四）转膜（五）免疫反应（六）化学发光，显影，定影（七）凝胶图象分析这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。 Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。耗材： 硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（2020cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L TrisHCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml 8.0 约10ml10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml溶解后，4保存，保存时间为1周。1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。0.5mol/L TrisHCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。20Tween20Tween20 20ml 蒸馏水至 100ml混匀后4保存。（二）使用液单去污剂裂解液（50mmol/L TrisHCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100?g/ml PMSF）： 1mol/L TrisHCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml蒸馏水至50ml 混匀后， 4保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100?g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）NaCl 8.0gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44g (Na2HPO4.H2O 1.56g Na2HPO4.12H2O 3.58g)KH2PO4 0.2g蒸馏水至 1000mlG250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考马斯亮蓝G250： 100mg 95乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸馏水至 1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保存。0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸馏水至 100 ml高温灭菌后，室温保存。100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后，20保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/LNaCl进行100倍稀释成1mg/ml，20保存。10分离胶和5浓缩校10分离胶（两块胶，10ml） 5浓缩胶（两块胶，5ml）10%AP（过硫酸胺） TEMED加 TEMED后，立即混匀即可灌胶。还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris?HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10 SDS，0.5溴酚蓝，50甘油）0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39gSDS 0.5g溴酚蓝 0.025甘油 2.5ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1 SDS）Tris（MW121.14） 3.03g甘氨酸（MW75.07） 18.77gSDS 1g蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用35 次。转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037 SDS，20甲醇）半干转1X电转液：甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（MW121.14） 5.8g SDS0.37g 甲醇 200ml蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次。湿转1X电转液：甘氨酸（MW75.07） 11.25gTris（MW121.14） 2.375g SDS0.375g 甲醇 200ml蒸馏水至 1000ml溶解后4保存，次溶液可重复使用35次。TBS缓冲液（100mmol/ L Tris?HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）1 mol/ LTrisHCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸馏水至 1000mlTBST缓冲液（含 0.05Tween20的TBS缓冲液） 20Tween20 1.65mlTBS 700ml混匀后即可使用，最好现用现配。封闭液（含5脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g TBST100ml溶解后4保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2SDS，62.5m mol/L TrisHCl pH6.8）14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巯基乙醇) 700 ml（通风厨里加） SDS 2g 0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） 12.5ml 超纯水至 100ml配制时，在通风厨内进行。 4保存。可重复使用1次。10X丽春红染液丽春红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释10倍。显影液：H2O 365ml A 125ml B 5.1ml C 4.875ml4保存。定影液H2O 363.5ml A 125ml B 11.5.ml4保存。抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml化学发光试剂购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。操作步骤SDS-PAGE转膜封闭一抗显色或化学发光显影二抗蛋白样品制备洗膜（一） 蛋白样品制备（1）贴壁细胞总蛋白的提取：（整个操作尽量在冰上进行）收集细胞，加裂解液100ul漩涡混匀，冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。在4下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于20保存。（二） 蛋白含量的测定（1） 制作标准曲线1、 从20取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。2、 取适量的蛋白标准稀释至终浓度0.5 mg/ml ；按照下表将0.5mg/ml BSA和稀释液PBS加到96孔板中，并取样品2ul加入96孔板中，加PBS至20ul.（样品和标准品均设置复孔）3、 按A:B=50:1配制适量的BCA工作液，混匀，室温24h内稳定。各孔加入200ulBCA工作液3730min测定A562，求平均值，绘制标准曲线。编号123456780.5mg/ml BSA(ul)01248121620PBS(ul)2019181612840得到标准BSA浓度(ugul)00.0250.050.10.20.30.40.5（三） SDSPAGE电泳电泳时间一般为23h，电压为80V 30min;120V 3h较好，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。SDS-PAGE 分离胶浓度最佳分离范围6%50-150kD8%30-90kD10%20-80kD12%12-60kD15%10-40kD 配制10%的过硫酸铵 配制12%分离胶（5ml) 待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水 聚合40分钟后，倒掉蒸馏水 配制5%浓缩胶（2ml）灌浓缩胶 插上梳子，聚合20分钟 注意：灌胶过程中避免产生气泡（四）转膜转膜详细操作过程：（1）转一张膜需准备6张7.08.0cm的滤纸和1张7.38.6cm的PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF膜则在M-OH中浸泡10min以上后转入TBS液中平衡。将滤纸浸入TBS液中润湿。（2）在加有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很易裂）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。轻轻划开分离胶与玻板左右两边的接触面，不然取胶时容易弄破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡（膜盖下后不可再移动）。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。注意膜在正极+侧，分离胶在负极-侧。标记正反面。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。湿转一般用400mA转移1:30 h，根据分子量大小调整。转移方法的选择：v 半干转 用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法； 适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的； 1.2-2MA/CM2 1h v 湿转 将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的方法； 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h（五）免疫反应（1）封闭：转完后将膜用去离子水或TBST从下向上浸湿后吸干，将膜在含5%脱脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20)的平皿中，室温下封闭1h。（2）一抗孵育：将一抗用一抗稀释液或TBST稀释至适当浓度（在15ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。(本实验室用封膜机将膜蛋白密封)（3）二抗孵育： 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。（六）化学发光，显影，定影（1）将A和B两种试剂在EP管中等体积混合；1min后，将此混合液充分涂抹在膜蛋白面上；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。（2）在暗室中，将1显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为12min（2025），温度过低时（低于 16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为510min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。（七） 凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。 高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 信号下降太快高 背 景信号弱或无信号原因解决办法抗原量不足增加上样量蛋白质在储存过程中降解重新制备样品转膜不完全转膜后确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、保证电极正确装配、控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。膜的错误选择选择合适膜的孔径：22kD 蛋白选用 0.45m孔径 22kD 蛋白选用 0.22m孔径抗原被封闭液遮蔽优化封闭液、缩短封闭时间、减小封闭液中蛋白浓度。抗体增加抗体浓度、注意抗体储存条件（避免反复冻融）。曝光时间过短延长曝光时间底物延长底物孵育时间非特异性条带原因解决办法底物太灵敏选择合适的底物交叉反应选择单克隆抗体抗原浓度太高降低抗原浓度抗体浓度太高降低抗体浓度曝光时间太长减少曝光时间其 他现象原因解决办法荧光萃灭快二抗浓度太高膜干燥降低二抗浓度保证膜的湿润度条带内出现不显影圆点转膜过程中有气泡转膜时赶尽气泡条带不完整底物孵育不均匀用保鲜膜均与孵育底物反影（白色条带、黑色背景）HRP浓度过高降低二抗浓度散在小圆斑封闭液有杂质颗粒