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种子检验学论文 主 题 SSR分子标记在种子检验中的应用与发展进展 学 院 农学院 专 业 种子科学与工程 姓 名 学 号 SSR分子标记在种子检验中的应用与发展进展摘要：利用 DNA分子标记技术（SSR）进行品种鉴定是一种非常重要的新型种子检验技术，从DNA分子水平上进行品种鉴定具有准确可靠、成本低、自动化、不受环境影响等优点， SSR分子标记技术在品种鉴定方面具有广阔的应用前景。关键词：DNA；分子标记；品种；纯度；真实性；鉴定一、引言分子标记是在DNA水平上对基因型的标记，它是遗传标记的一种。其一分子标记直接以DNA形式表现，在植物的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；其二分子标记不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；其三用于分子标记的基因数量多，多态性高，遍及整个基因组；其四许多分子标记表现为显性或共显性，能够鉴别出纯合和杂合的基因型。由于这些特点，分子标记在遗传、育种和种子检验中有着广泛的应用1。二、种子检验的起源、发展、现状种子检验起源于欧洲。18世纪中叶至19世纪中叶，欧洲各国种子贸易不断发展，一些不法商贩在种子中掺杂使假，牟取暴利，严重影响了使用者的经济利益，针对这些不法行为，许多国家颁布了种子管理法令。1869年德国的Friedrich Nobbe在萨兰德建立了世界上第一所种子检验实验室，开展了种子真实性、种子净度和发芽率检验等项工作，并于1876年编写出版了种子学手册。1875年欧洲各国在奥地利召开了第一次欧洲种子检验站会议，讨论了种子检验的要点和控制种子质量的基本原则。20世纪初，亚洲和其他州的许多国家也陆续建立了若干种子检验站，开展种子检验工作。1906年德国汉堡举行了第一次国际种子检验大会。1924年英国剑桥召开了第四次国际检验大会，决定把欧洲种子检验协会改为国际种子检验协会（简写ISTA）。进入21 世纪以来随种业集中化、多元化、国际化的发展；品种繁育速度的不断加快；种子生产的自动化、专业化程度不断提高2。对种子检验的要求愈来愈高，随着科学技术的发展，各种技术和方法一并用于种子检验中的，使种子检验得到了迅速发展，国际种子检验规程得到了不断地规范。分子标记在种子检验中也有着广泛的应用，并且取得了很大的进展。下面就几种主要作物的SSR分子标记检验的意义、应用与进展做以介绍。三、SSR分子标记在玉米、小麦种子检验中的应用与进展1、SSR分子标记检验玉米杂交种纯度玉米杂交种纯度鉴定是玉米种子质量控制体系中的关键环节。 现在玉米杂交种纯度鉴定方法有形态鉴定，同工酶或种子贮藏蛋白质电泳技术等。根据该技术制定的玉米杂交种纯度鉴定技术标准正在得到广泛应用，然而由于部分玉米杂交种双亲间种子贮藏蛋白质多态性差，或由于杂交种谱带表现为非互补类型等原因，利用种子贮藏蛋白质电泳技术难以找到杂交种特征带 使得这部分玉米杂交种缺乏快速可靠的纯度鉴定手段3。分子标记技术的出现为玉米杂交种纯度鉴定提供了新的手段。 SSR标记由于具有数量丰富、多态性高、遗传上呈共显性、扩增稳定、引物序列易于交流等特点受到广泛重视。Smith4、李晓辉等5的研究表明，绝大多数的玉米杂交种SSR 位点等位基因呈共显性，利用SSR标记技术进行纯度鉴定的关键之一是扩增片段检测技术。为解决部分杂交种无快速可靠纯度检验方法的问题，满足实际应用中对玉米杂交种纯度鉴定技术简单、快速和准确的要求。李汝玉6等利用种子贮藏蛋白质电泳技术难以鉴定的玉米杂交种及相应亲本和一组高多态性玉米SSR位点引物为材料，对玉米子粒DNA提取、扩增片段检测方法等进行了研究、筛选到了适合上述杂交种纯度鉴定的SSR位点引物，提出了一套对仪器设备要求相对较低、程序简单、较为快速的利用SSR标记进行玉米杂交种纯度鉴定的技术程序。如下图为1个登海11 样品的纯度检测结果。M 为分子量标准(PBR322/Mspl) . 1-24泳道为登海11种子样品。SSR 引物为phi053结果表明，利用这套包括玉米干种子DNA提取和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在内的相对简单易行的技术进行玉米杂交种纯度鉴定是完全可行的。 鉴于玉米SSR 标记丰富的多态性和目前已开发出的近2000对的玉米SSR引物数量，不难利用本研究方法筛选出适合任何一个玉米杂交种纯度鉴定的相应SSR 引物，彻底解决种子贮藏蛋白质电泳技术纯度鉴定方法不能适用于全部玉米杂交种纯度鉴定的难3。2、分子标记检验小麦种子纯度种子纯度是评价小麦种子质量的重要指标之一,国家标准规定小麦良种的纯度应达到99% 7 。目前我国采用的小麦种子纯度检测方法分为组织化学鉴定法、幼苗鉴定法、籽粒醇溶蛋白鉴定法8 。这些方法在小麦种子纯度和品种一致性的检测中起着重要作用,但是这些方法都有一定的缺陷或局限性。鉴于这种状况,采用分子标记检测种子纯度的研究在玉米9 、甜菜10 、大豆11 、番茄12 、小麦13 、水稻14 等各种作物上陆续开展。在用于种子纯度检测的分子标记中,SSR(Sim2ple sequence rep- eats) 11, 15 和AFLP( Amplifiedf ragment length polymorp hism) 4 标记最为常用,其次是RAPD(Randomly amplified polymorp hic- DNA ) 标记16 。以往的研究中,研究者只是采用一种分子标记从事种子纯度检测的研究,而每种分子标记均具有某些缺陷。王立新等研究比较了PIC值较高的63对SSR引物、21EST2SSR引物和21对AFLP2SCAR引物与400个小麦品种的扩增产物,根据多态性高、带型清晰、分布于不同染色体的原则,筛选出7对SSR引物、5EST、2SSR引物和3对AFLP2SCAR引物为检测种子纯度的核心引物,以上引物均具有较高的PIC值,并且带型清晰(图1图3)，可以满足检测种子纯度的需要。图1 SSR引物c f d65 的带型 Fig. 1 Pattern of SSR primer cfd65图2 EST2SSR引物ksum62 的带型 Fig. 2 Pattern of EST2SSR primer ksum62图3 AFLP2SCAR引物bhw120 的带型 Fig. 3 Pattern of SCAR primer bhw120随着分子标记分析技术不断简化和有关仪器、试剂的国产化,其试验成本大幅度下降,完成1个品种纯度检测的试验成本仅需500元左右,测试时间56 d。与醇溶蛋白法相比,测试时间多1d ,成本不相上下,但分子标记遍布小麦整个基因组,多态性高、数量丰富；分析技术灵敏度高,可以区别具有1bp之差的带型,因此检测结果的可靠性高于醇溶蛋白 17。四、结束语种子质量是种子企业的生命,将一套准确、快速、简单、经济的杂交种子纯度鉴定技术推广到各种子企业,可满足种子企业生产经营的迫切需要,为企业种子质量管理提供技术保障,防止纯度不合格种子流入市场,增强企业市场竞争力,有效维护种子企业诚信品牌和良好形象,保障农业生产用种安全,保护农民权益,维护农村社会稳定。随着SSR分子标记技术的发展成熟,其应用于杂交种子纯度检测的实践将展示出更广阔的前景,创造良好的经济效益和社会效益18。参考文献：1张春庆，王建华.种子检验学，高等教育出版社，2006.12王川飞.谈国际种业的发展趋势，南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京2100953李汝玉,李群,谭振馨,颜廷进,张文兰,宋国安,侯淑贞. 利用SSR标记技术检测玉米杂交种纯度, 山东省农科院作物所, 济南2501004Smith J S C and Register J C. Genetic purity and testing technologies for seed quality: a company perspective J. Seed Science Research, 1998,8:2852935李晓辉，李新海，李文华等.SSR标记技术在玉米杂交种种子纯度测定中的应用J.作物学报,2003,29(1):63686李汝玉，杨平平，宋国安. 简单重复序列(SSR)及其在品种鉴定及种子检测中的应用J.种子,1999,(5):3335 7GB 4404. 121996 ,粮食作物种子. 禾谷类 S .8GB/ T 3543. 521995. 农作物种子检验规程. 真实性和品种纯度鉴定 S .9田雷,曹鸣庆,王辉,等. AFLP 标记技术在玉米种子真实性及品种纯度鉴定中的应用J . 种子世界,2000 (11) :35236.10Riek J De , Calsyn E , Everaert I , et al . AFLP based alternatives for t he assessment of Distinctness J . Theoretical and Applied Genetics ,2001 ,103 :125421265.11关荣霞,刘燕,刘章雄,等. 利用SSR 方法鉴定大豆品种纯度J . 分子植物育种,2003 ,1 (3) :3572360.12Cooke R J , Bredemeijer G M M , Ganal M W, et al . Assessment of t he uniformity of wheat and tomato varieties at DNA microsat2ellite lociJ . Euphytica ,2003 ,132 :3312341.13石海波,王立新,李宏博,等. 用SSR 标记区别小麦品种种子混杂和SSR 位点不纯的研究J . 分子植物育种,2006 (4) :5132519.14Sundaram R M , Naveenkumar B , Biradar S K, et al . Identifica2 tion of informative SSR markers capable of dis -tinguishing hybrid rice parental lines and t heir utilization in seed purity assessmentJ . uphytica , 2008 ,163 :215222415李汝玉,李群,谭振馨,等. 利用SSR 标记技术检测玉米杂交种纯度J . 玉米科学,2005 ,13 (1) :15218.16颜廷进,