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新型核酸分子荧光探针-分子信标的研究进展山东农业大学 化学与材料科学学院 宋伟杰 摘要 分子信标是一种设计巧妙的新型荧光标记核酸探针。它的最初设计是用来检测核酸，但是由于分子信标是特殊的发夹结构构成的，因此具有很强的特异性识别靶标序列的能力。分子信标对靶分子的检测具有高灵敏度、强选择性和实时监测等多种优点。因此，它在多重SNP测定和细胞内病毒表达等核酸检测及其多种DNA-蛋白质，DNA-DNA损伤等生物化学分析、生物医学研究及环境监测等各大领域发挥着重大作用。引言 1996年Tyagi和Kramer等人设计了一种可以特异性识别核酸序列的新型荧光探针。分子信标是由特殊的发夹结构构成的，因此具有很强的特异性识别靶标序列的能力1。分子信标的优点很多，如高灵敏性，强选择性及特别适用于活体实时监测功能。因此，其能够得到飞速发展。分子信标在生物化学分析、生物医药学研究等各大领域得到了广泛应用。并且随着科学技术的发展，新型分子信标也将得到不断的发展与进步，分子信标的应用领域也会不断拓展。1 分子信标的结构及作用原理1.1 分子信标的结构 分子信标是通过荧光标记而形成的。分子信标一般分为两种:一种是包含了环-茎两部分结构的单链寡核苷酸组成的，它的形状类似发夹型。另一种是无茎的，不含有双链结构的茎杆区，只含有单链的环状结构。环-茎型寡聚核苷酸序列的环上的寡聚核苷酸序列是分子信标的基因识别部分，一般含有15-30碱基序列。作为环状部分能够与靶基因自发进行杂交。茎区一般长度为5-12碱基互补序列，茎区是一个发夹结构，茎区两端分别连接有荧光基团和猝灭基团。一般来说，荧光基团和猝灭基团都是一些有机基团。在分子信标的5端和3端通过连接臂连接上了荧光基团和猝灭基团。无茎分子信标具有良好的柔韧性并且其结构如同一个闭环结构，当分子信标与靶序列特异性结合之后，探针与靶标形成的双链具有刚性结构从而使得荧光分子和猝灭分子分开，荧光恢复。1.2 分子信标的作用原理 在自由状态下，分子信标未与靶分子进行特异性结合，由于茎杆区互补序列的结合使得探针分子形成发夹结构从而成为发夹探针。在自由状态下，由于茎部分两列互补碱基对之间的氢键连接，使得荧光基团和猝灭基团距离很近，荧光基团将能量转移给猝灭基团而发生荧光猝灭。有很多研究发现纳米金的猝灭效率更高，几乎能接近 100%2,3,4当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成的链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子之间的距离逐渐增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者之间距离的6次方成正比5。杂交之后，分子信标的荧光几乎完全恢复。并且荧光强度与溶液中靶标序列的量成正比，所以可以用来作定量分析。当然，在高温、高pH、DNA损伤等条件下会使分子信标的荧光信号增强，这也就决定分子信标的多用途性。无茎分子信标不含有与靶标无关的序列，设计和合成上相当简单，成本降低。由于二甲氨基偶氮苯甲酰（DABSYL）和黑洞猝灭剂（BHQ-2）对多种发射光谱不同的荧光基团都有很好的淬灭作用，在量子点分子信标中，也经常使用这两种猝灭基团6,7。无茎分子信标还具有响应快、特异性强等特点。但是由于其结构上少了茎区，稳定性有所下降，背景荧光相互增强。研究者们研究了很多方法来提高其信噪比。如设计 in-stem 分子信标8、引入多个荧光猝灭基团9或利用共轭聚合物作为发光基团10以及采用受激准分子发射11,12、电化学发光13等方法。2 分子信标的应用2.1用于核酸检测分析2.1.1实时定量PCR测定靶标的浓度 在PCR反应体系中加入扩增靶标序列互补的分子信标，然后用荧光ABI PRISM 7000型PCR监督，测定其扩增循环-荧光曲线。这样对于那些多余的分子信标无需分离。并且还能够实时定量的测定其扩增靶标的量。分子信标作为实时荧光探针是非常适合的。目前，分子信标已经成功的应用于各种病原体核酸的检测。作为一种新型的检测手段，其具有很多常规方法所不具有的优点。测定时具有很高的灵敏度和特异性。操作简单易行、可避免污染。能够实时的检测14-16。随着科学技术的发展，把分子信标探针与PCR技术相结合来监测的报告越来越多。例如，对果汁和牛奶中大肠杆菌0157、H7的检测17；对沙门氏杆菌的半自动快速检测；对人体肺癌细胞中骨形成的蛋白质受体mRNA的识别检测；对细菌人工染色体克隆的检定；对HIV-1的定量分析；Y染色体的精确测定等。2.1.2 活体细胞中的RNA的测定 能够实时的对细胞体内的mRNA表达进行有效的检测将在疾病诊断、药物研发及分子生物学等各个方面发挥重大作用。然而在生物学以及近年来的反义核酸研究中，对活细胞内的mRNA与反义寡核酸链之间的杂交进行描述也是一大难题。但是分子信标的使用却解决了重大难题。 传统的检测方法是传统脂质体或小分子量到引物导入分子信标，这种方法低效、进入细胞时间很长并且经常对分子信标结构造成破坏。Nitin等人利用分子信标的环柄结构及荧光特点，在分子信标的一端连接TAT肽段，由此使得分子信标能够主动进入细胞、发射荧光和杂交。Matsuo等人利用分子信标研究了BFGF mRNA在细胞内代谢过程18。其主要方法是设计并合成了与待测目标mRNA序列互补的分子信标和对照组细胞的荧光会随培养时间的延长不断增强。通过实验研究可得，因为细胞内的核酸酶会水解分子信标，从而使得结构遭到破坏而产生荧光。PNA分子信标能够有效避免核酸酶的水解，从而使得荧光强度准确反应活体mRNA的代谢19。Sokol等利用为注射方法检测到了人类白血病细胞K562中RNA与分子信标的杂交。Perlette等人也利用微注射法引入分子信标，对单个活细胞中的RNA进行了检测，并利用ICCD成像系统得到了一系列反应分子信标与RNA结合的荧光图像。针对于细胞内核酶降解而产生的假阳性信号，Gang Bao等人设计了双重PRET分子信标用于活细胞内检测mRNA。Weihong Tan等提出了在分子信标干部位用化合物Z和P代替碱基C和G。Yeh 等20则设计特异的量子点分子信标(quantum dot molecular beacon, QD-MB)实时监测活细胞内病毒复制过程。以及Chang等用汞离子和碱基T的特殊作用设计的新型分子信标，都避免了假阳性信号的出现。分子信标目前主要应用于荧光定量PCR、活体内核酸检测等21。但是分子信标技术也存在这局限性。细胞核内的非特异性信号导致的高荧光信号背景会明显降低分子信标技术在活体细胞内的检测灵敏度和动态范围。另外，分子信标的非特异性的开环会使与分子信标相关的杂交试验受到干扰，导致对实验结果的错误解释。2.1.3 利用多色分子信标分析基因突变 基因突变是人体发病的重要原因，对于基因突变的预防诊断和治疗显得尤为重要。传统的基因变异检测方法通常是通过很多重复的移液、离心、培养、等步骤。过程十分复杂，并且费时费力。因此探索一种方便快捷的检测方法将为基因突变检测的发展起到巨大的推动作用。通过利用多色分子信标进行基因突变检测，使得过程更加简单、快速并且更加灵敏。这种方法同时推动了医学中对疾病机理研究和治疗的快速发展。Kostrikis等建立了基因光谱分型检测技术，对HIV辅助受体CCR5等位基因的突变进行检测。Maarten等和Belinda等分别对亚甲四氢叶酸还原酶的基因进行了研究。复合聚合酶链反应(复合PCR)-膜芯片斑点杂交、聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法、测序等22。亚甲四氢叶酸还原酶的某些基因变异和许多心血管疾病以及神经管缺陷疾病的发病有关。此种标记存在着许多优点。如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射波长的荧光发射基团，可在同一激光下，通过检测这些特征波长的荧光强度实现在统一体系中的多基因分析。分子信标和线性寡核苷酸探针相比较而言，分子信标的茎环结构的分子信标检测特异性更高，对于靶序列中单个碱基的错配缺失或插入突变均能够检测出来。所以分子信标在分析基因突变过程中具有重要的应用作用，多色分子信标也为疾病的预防、诊断和治疗提供了重要手段和方法。2.2 用于蛋白质和DNA的检测分析 根据目前对于蛋白质和DNA的分别检测及对于其之间的相互作用检测将在现代生物科学中具有非常广阔的前景，但是也是具有巨大挑战的课题之一。人们对于蛋白质进行检测中，运用了分子信标与蛋白质进行结合时，发现其荧光强度也会增加，由此说明分子信标对于蛋白质也是具有一定的识别能力的。分子信标与核酸识体进行有机结合从而得到组合体叫做分子识体。分子信标识体的结构一般来说是一种单链的DNA或RNA分子，通常含有25-60个核苷。目前在蛋白质检测中运用分子信标识体主要应用于凝血酶检测。另外还有一种是基于检测蛋白质结合过程中的各向异性荧光变化。这种探针是由单荧光基团标记的识体构成的。另外重要的研究是分子信标应用于研究DNA-蛋白质之间的相互作用。研究发现，DNA-蛋白质之间的相互作用对于大多数生物的影响十分显著。分子信标的使用对于研究DNA-蛋白质之间的相互作用具有重要作用，并且从而使得人们更加深入的了解DNA-蛋白质之间的相互关系。人们在研究与探索DNA-蛋白质之间的相互作用时主要使用了交联技术、过滤结合技术、DNA足迹法、凝胶阻滞分析、圆二色性光谱、亲和色谱、X射线晶体衍射、荧光光谱分析等方法与技术。从而得到了大量关于DNA-蛋白质两者之间的相互作用的信息：如，结合位点、结合区的长度和特异性等。Li等研究了分子信标和SSB结合的摩尔比和结合常数。Fang等还研究了乳酸酶（LDH）与分子信标DNA的相互作用。实验表明，分子信标能够有效的应用于DNA-蛋白质之间的定量分析检测及核酸与蛋白质的相互作用研究。2.3 分子信标在DNA生物传感器中的应用 DNA生物传感器是一种能够将目的DNA的存在转变为可检测的电、光、声等信号的传感装置。DNA生物传感器和其它的传感器一样，包含两个部分：即分子识别原件（DNA）和转换器。原理实在是在电极上固定一条含有十几到上千个核苷酸的单链DNA（ssDNA），通过DNA分子杂交，对另一条含有互补的碱基序列的DNA进行识别，结合成双链DNA（dsDNA）23。杂交反应在敏感元件上直接完成，换能器能够将杂交过程中所产生的变化转变为电信号。传统的DNA转换器所使用的检测手段是基于支链ss-DNA之间的杂交反应进行待测物的检定24。为了进一步提高杂交检测的特异性和选择性，1996年Tyagi和Kramer首次建立了分子信标探针。分子信标能够特异性检测靶序列，并且能够将不同序列的多种分子信标固定在基片表面，并保持其原有性质的不变。2.4 MB技术的应用 MB是一种设计巧妙的新型荧光核酸探针，自1996年Tyagi和Kramer报道以来，因其背景信号低、灵敏性高、特异性强、操作简单等优点，使得此技术在短短的几年之内得到了长足发展。一个传统的MB是由环、茎、荧光团和猝灭团四个部分组成的。MB与线形探针相比较而言，无论是选择性还是从特异性等多个方面都有其优势所在，并且为了提高MB的选择性和灵敏度，进一步扩大MB的应用领域，研究者设计了不同结构的MB。 Fan等人通过杂交前后电信号分子与电极表面的距离不同而引起不同的电信号对目标DNA进行检测，为电化学生物传感器的发展奠定了重要的基础。Immoos等人设计了DNA-PEG-DNA式的发夹结构。Zhao等25用存活蛋白的 MB 检测膀胱肿瘤患者尿液沉渣观察到存活蛋白阳性的肿瘤细胞，提示基于 MB 的特异靶分子检测可应用于恶性肿瘤早期诊断。Lo 等26设计了能特异性结合肿瘤细胞特异表达的成纤维细胞激活蛋(fibroblast activation protein, FAP)的分子信标。Zheng等27巧妙地将MB 与光动力治疗原理，用光敏剂及其淬灭剂取代经典 MB 的荧光基团，设计了含特异肽片段或碱基序列的光动力分子信标。利用杂交后电化学信号的增加对互补DNA序列进行检测。Chen 等28设计了特异结合c-raf-1 mRNA的photo-MB29。此外，用量子点标记的 MB 也能有改善荧光信号的特异性。3 结语随着科学技术的不断进步，分子信标技术也得到了飞速发展。近年来，分子信标技术已经广泛应用于结构和分子生物学、基因和生物技术等重要领域30-31。分子信标具有特异性高且无需分离的特点，从而使得其在核酸检测中有着很广泛的作用。在注重功能基因研究的后基因组时期，分子信标将会被应用于基因突变引起的疾病的研究、活细胞中的RNA的检测、蛋白质的检测及生物芯片等的研究。随着分子信标技术的发展和新型分子信标的不断出现，分子信标在基因诊断、基因治疗等方面发挥了越来越重要的作用。 4 参考文献1 丁黎娟等.分子信标的研究及应用J.科教前沿，2010,21. 2Pinpin Sheng; Weihong Tan. 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