全反式维甲酸对高血压大鼠体内apelin-APJ信号系统的影响.doc

【摘要】 目的：探讨全反式维甲酸（atRA）对高血压大鼠体内心血管活性多肽apelin及其受体APJ信号的影响。方法：采用12周龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）及其同源对照WKY大鼠，经腹腔注射atRA，为期1月。分别用实时荧光定量多聚酶链式反应（PCR）与免疫印迹技术测定atRA 治疗后SHR体内apelin和APJ受体的表达情况。结果：与WKY对照组相比，SHR心脏组织中apelin及其受体APJ的mRNA和蛋白表达明显下调（P均001）。而atRA治疗后SHR(低、高剂量atRA组)大鼠心脏组织中apelin、APJ表达出现上调（P均005）。结论：长期atRA治疗促进SHR大鼠心脏组织中apelin及其受体APJ的表达增加，提示转录调节剂atRA很可能对人类高血压病防治具有积极作用。 【关键词】 apelin 维甲酸 高血压 Effects of all|trans retinoic acid on the apelin-APJ signaling in spontaneously hypertensive rats/ZHONG Jiu|chang, HUANG Dong|yang, YU Hui|min, XIE Jian|ping, YU Xi|yong, HUANG Xiao|zhong, LIN Qiu|xiong/Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007，16（3）：210 Abstract：Objective:apelin, a newly identified angiotensin (Ang) homologue, has been shown to act as an endogenous ligand of the orphan receptor APJ and implicated in essential hypertensionapelin can regulate blood pressure through antagonizing of Ang actions and potentiating of nitric oxide (NO) release The aim of the present study is to explore effects of all|trans retinoic acid (atRA) on the apelin|APJ signaling in hypertension.Methods:Twelve|week|old male spontaneously hypertensive rats (SHR) were treated with atRA given as daily intraperitoneal injection for one month; age| and sex|matched Wistar|Kyoto (WKY) rats and placebo|treated SHR served as controls Real|time PCR and Western blot were performed to examine mRNA and protein expressions of apelin and its receptor APJ in rats after atRA treatment.Results:In placebo|treated SHR, mRNA and protein expressions of apelin and APJ receptor were markedly depressed compared with WKY rats (P001, respectively)However, in atRA-treated SHR, significant up|regulations of apelin and APJ receptor expressions were observed in heart (P005,respectively).Conclusion:Chronic atRA treatment contributes to enhancements of cardiac apelin and APJ receptor in SHRThus, atRA, as a transcription|modulating drug, may have potentially clinical values in the prevention and treatment of human essential hypertension. Authorsaddress：Research Center of Medical Sciences, Guangdong Provincial Peoples Hospital, Guangzhou,Guangdong,510080, China Key words： apelin;Retinoic acid;Hypertension 肾素-血管紧张素系统(RAS) 参与高血压病等心血管系统疾病的发病过程，而血管紧张素（Ang ）在其中起关键调节子作用1,2。新近发现与Ang 具有同源性的心血管活性多肽apelin是孤儿G蛋白偶联性受体APJ的内源性配体，具有扩血管、增强心肌收缩力、促进一氧化氮（NO）合成以及对抗Ang 作用的特性，其基因异常表达涉及高血压病的发病过程35。全反式维甲酸（all|trans retinoic acid，atRA）是一种核激素受体类转录调节剂，可通过调控RAS系统中Ang 及其1型受体（AT1）等基因表达水平，参与高血压病心血管保护效应2,57。但atRA是否调节Ang 、AT1的同源类似物apelin、APJ受体表达进而在高血压中起作用，值得进一步探讨。本实验通过实时荧光定量聚合酶链反应（RQ-PCR）以及免疫印迹等技术，旨在探讨转录调节剂atRA对自发性高血压大鼠（SHR）心脏组织中apelin-APJ系统基因与蛋白表达的影响。 1 资料与方法 11 实验动物由上海市高血压研究所提供12周龄雄性SHR大鼠24只，体重约为220250 g，随机分成3组：SHR对照组（SHR-C，n=8）；低剂量atRA治疗组（SHR-L，n=8）；高剂量atRA治疗组（SHR-H，n=8）。正常血压雄性同源大鼠WKY 17只，随机分成2组：正常对照组（WKY-C，n=9)；atRA治疗组（WKY-R，n=8）。经腹腔给大鼠注射atRA（10 或20 mg/kgd）或安慰剂，为期一个月。实验结束后，将大鼠处死后开胸取其心脏，液氮冻存待测。 12 标准品的阳性克隆与鉴定根据目的基因apelin，APJ及内参基因3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）在基因库（Genebank）上登陆的序列信息，用Primer Express软件设计引物及其特异性的TaqMan探针（表1）。采用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取心脏组织总RNA，测其吸光度(A)值后，置-70备用。采用常规RT-PCR试剂盒（Invitrogen公司，美国）合成cDNA，用高保真酶pfx扩增apelin、APJ以及GAPDH，反应总体积50 l，反应条件为 95 2 min，95，30 s，55 30 s,70 1 min，末次反应于70保温8 min，共35个循环。RT-PCR产物经2琼脂糖凝胶电泳，割胶后纯化扩增片段后，将之与pGEM-T easy载体（Promega，美国）按摩尔数（31）的比例在T4连接酶作用下进行连接反应，构建含apelin、APJ以及GAPDH基因的重组质粒。将重组质粒转化入JM109感受态细胞内，进行蓝白斑筛选阳性重组子，最后采用PCR扩增、酶切以及测序鉴定。表1 实时定量多聚酶链式反应（PCR）中引物和探针序列探针5端标记6-羧基荧光素（FAM）；3端标记6-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）13 实时荧光定量PCR反应验证成功的酶切质粒DNA进一步纯化后成为apelin、APJ以及GAPDH基因的阳性克隆标准品。将标准品测吸光度（A）值，计算出拷贝数，稀释成每l体积109、108、107、106、105、104、103拷贝数浓度梯度，建立定量的标准曲线并进行样品检测，反应体系为50l。反应条件：50 2 min；95 10 min；最后95 15 s,60 1 min，共40个循环。运行后在计算机上作标准曲线。从-70冰箱中取出样品cDNA，每个取2l加入25l反应体系，置于ABI PRISM 7700型荧光定量PCR扩增仪上，用标准品同样的反应条件进行扩增、观察、记录并分析结果。 14 免疫印迹用常规的免疫印迹法检测大鼠心脏apelin与APJ受体蛋白表达水平。首先提取心脏组织总蛋白，经离心后取上清，用Bradford法测定样品蛋白浓度。取50g总蛋白进样于预灌制的1215%聚丙烯酰胺凝胶中，100V电泳2 h，然后电转移至硝酸纤维素膜（Amersham，美国）。用1牛血清蛋白室温封闭1 h后，将膜分别采用抗apelin、APJ-抗孵育过夜。接着室温下将膜用碱性磷酸酶标记的二抗孵育1 h, 洗膜3次，每次10 min。最后用Western blot专用试剂（Promega，美国）显色成像, 对apelin与APJ特异性条带进行半定量分析，-actin蛋白作为内对照。 15 统计学处理采用SPSS 110软件统计分析，检测结果以均数标准差(s) 表示，采用方差分析，组间比较采用q检验，P005为差异有显著性。 2 结 果 21 实时定量PCR中阳性标准品的克隆与鉴定如图1所示，每个基因从转化菌落中随机挑选五个重组克隆子，菌落扩大培养后提取质粒，并以质粒DNA为模板，进行PCR扩增后发现特异性条带，分别为apelin（101 bp）、APJ（111 bp）以及GAPDH（83 bp），提示已成功地克隆了RQPCR中apelin、APJ以及GAPDH的阳性标准品。 图1 实时PCR中阳性标准品的鉴定 M：DNA 标志；泳道15:apelin(101bp)；泳道610:APJ(111bp);泳道 1115:GAPDH(83bp) 22 atRA治疗对SHR大鼠心脏中apelin、APJ mRNA表达的影响将apelin、APJ以及GAPDH阳性克隆的标准品测A值，定量并进行倍比稀释拷贝数浓度，在7700型扩增仪上扩增后将循环阈值（CT）经对数拟合图，得到定量标准曲线，起始模板浓度与CT值之间呈良好的线性关系（r值依次为0975、0990、0992,图2）。图2 实时PCR中定量标准曲线的建立 23 atRA治疗对SHR大鼠心脏中apelin、APJ蛋白表达的影响图4示apelin与APJ受体蛋白表达水平，单位为apelin、APJ与-肌动蛋白（actin） A值比。与WKY对照大鼠相比，SHR大鼠心脏组织中apelin、APJ蛋白表达明显下调apelin:(064003) (087003)；APJ:(073004)(1007)，P均001。经过atRA治疗后，SHR-L和SHR-H大鼠心脏组织中apelin、APJ蛋白水平明显增加apelin:(079003),(083003)(087003)；APJ:(088005),(092005)(1007)，P均005。各组大鼠体内-actin蛋白水平差异无统计学意义。 3 讨 论研究表明apelin-APJ系统与RAS系统在心血管信号转导中存在交互作用，两者表达或者活性异常可能涉及高血压病等心血管疾病的发生、发展5,8,9。人apelin基因定位于染色体 Xq25-261，由3个外显子和2个内含子组成，mRNA长度为2673 bp。经纯化确认apelin存在多种亚型，长肽有apelin-36，-31，-28,短肽有apelin-19，-17，-13，-12，其中apelin-36和apelin-13较为常见。在体内同样条件下产生的长、短肽apelin，在体内外发挥的生理作用却不尽相同3,5,9,10。有趣的是，孤儿受体APJ作为apelin的受体，与Ang 1型受体AT1在跨膜区具有54%的高同源性。Northern 印迹（blot）、原位杂交分析发现apelin及其受体APJ与Ang 、AT1受体在心血管、脑、肾脏组织分布部位很相似。APJ受体与AT1同属于7跨膜区G蛋白偶联性受体，然而APJ并不结合Ang，apelin也同样不能作用于AT1受体3,8,9。另外，apelin与Ang均为新近发现的血管紧张素转换酶（ACE）2 型（ACE2）的作用底物。ACE2与ACE高度同源，为RAS体系的关键调节酶，可拮抗ACE与Ang 的生理功效7。ACE2还可作用于apelin-13和apelin-36，产生更小的肽片段。鉴于apelin与Ang 在基因序列、受体、酶以及mRNA表达分布等方面有很多相似之处，故推测apelin可能具有Ang 相类似的生理功效，如维持血压稳定、调节水盐代谢平衡等3,9。作为一种新的心血管活性多肽，apelin不仅具有扩血管降压、增加NO生成、增强心肌收缩力之功效，而且在调节水盐代谢以及介导免疫调节方面也起重要作用。有趣的是，我们研究发现，与WKY对照大鼠相比，SHR心脏中apelin及其受体APJ基因和蛋白表达均明显下调。Ishida等11通过基因敲除技术证实在APJ受体缺失的小鼠表现出Ang 的血管收缩作用明显增强，NO水平下降，血压增高。而在既往研究中我们也发现SHR心脏中存在Ang -AT1信号的增强以及血清NO水平下调5，这可能与apelin-APJ系统表达下调有关。故我们推测在高血压中可能存在RAS与apelin-APJ系统之间的失衡。转录调节剂通过影响转录因子或与基因转录有关的信号转导通路而达到治疗作用，目前已在许多不同的领域广泛使用。特异性影响apelin和APJ转录、表达的药物，通过积极改善其内源性表达将对高血压的防治发挥重要功效5,8,9,11。众多资料表明atRA具有广泛的生物学效应，如参与正常心血管胚胎发育、细胞增殖、细胞分化、凋亡以及基因转录与表达的调控过程。己经证实atRA大部分生物活性是通过核内特异性维甲酸受体（RAR）和维甲类X受体（RXR）的激活而介导完成的。atRA通过核受体杂合（RAR/RXR）、DNA结合以及维甲酸受体反应元件启动引起靶基因的转录激活或转录抑制，从而发挥其生物学作用2,6,12。本研究发现，在apelin-APJ表达相对不足的SHR大鼠中，atRA可以通过异二聚体RAR/RXR介导的信号调节途径促进apelin及其受体APJ的基因与蛋白表达水平增加。长期atRA治疗可导致SHR体内AT1受体水平下降，NO生成增加，最终促使血压下降2, 提示atRA通过调控apelin-APJ以及Ang -AT1信号途径的平衡，很可能在人类高血压防治中发挥重要作用。作为一种核激素受体类转录调节剂，atRA代表着高血压及相关疾病的一个很有前景的临床治疗方向。参考文献：1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮158例疗效观察J;广东医学;1997年10期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮126例J;中国中医药科技;1999年06期 3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会J;江西中医药;/xyfm/class/.2002年05期 4 张随学 ,谭正辉 ,孙叶梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韩峰;3003例痤疮患者特征分析与控制对策J;中华医学美学美容杂志;/xyfm/class/.2002年06期 5 刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗J;临床医药实践杂志;2003年09期 6 高宜云;痤疮从肝论治J;中医药临床杂志;2004年03期 7 欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮J;中华皮肤科杂志;2004年09期 8 陈五一;痤疮辨治体会J;世界中医药;/yisheng/main/index.php.2007年03期 9 雷放;中药热敷治疗痤疮有效J;新中医;ht